[发明专利]一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，进一步涉及阴道微生物与精细胞间生理作用的研究，具体涉及一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法。

背景技术

阴道微生态失衡造成的女性生殖道感染是妇科常见病。据统计因感染性疾病就诊占门诊患者一半以上，排在前3位的是阴道炎、宫颈炎和盆腔炎，仅细菌性阴道病每年的发病人数就数百万，重者可引起慢性宫颈炎、宫颈癌及卵巢、输卵管肿瘤等疾病，同时也是造成不孕、早产、胎膜早破、低体重儿早产、复发性流产、绒毛膜羊膜炎等的主要原因，严重影响患者的身体健康与生活质量，并且临床数据显示患有阴道炎症时不孕率会上升，而研究证明适量补充阴道益生菌对炎症有缓解作用，同时也有希望在不孕症中得到应用

正常状态下，女性阴道内可分离出几十种微生物，包括:乳杆菌、棒状杆菌、双歧杆菌、类杆菌、梭形杆菌、非溶血性链球菌、肠球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、加德纳菌、消化链球菌，以及原虫、病毒、支原体和白假丝酵母菌等，其中乳杆菌是阴道正常菌群中的优势菌，其分离率达50％～80％。这些菌群与宿主、环境之间构成了相互制约、相互协调、动态平衡的阴道微生态系统

阴道微生态系统是人体四大生态系统中较为复杂的系统，它在人类的繁衍和疾病防御机制方面起着重要作用。有研究表明，由于部分阴道微生物对精细胞具有直接的生理影响，因此阴道菌群的失衡可能影响精子与卵细胞结合，从而直接导致不孕的发生。在这种情况下，有必要明确不同阴道微生物与精细胞间的生理作用，在此基础上通过阴道微生物的调节来促进精细胞在阴道内的活力。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，以解决精细胞在常规阴道环境中运动能力受影响的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是常规的阴道环境易产生菌群紊乱现象，从而导致妇科疾病的发生。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于不孕症治疗的微生态制剂制备方法，包括以下步骤：

1)从阴道分泌物中分离微生物，培养得到若干单菌落；

2)对所述若干单菌落中的微生物进行菌种鉴定，得到若干菌株；

3)取所述若干菌株，分别与精细胞在液体环境中共孵育，在显微镜观察下以各菌株与精细胞的粘附能力为依据筛选出目标菌株；

4)培养所述目标菌株，制备冻干粉菌剂。

作为优选，步骤1)中用于分离微生物的培养基包括LB基础培养基，MRS固体培养基，BHI固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的BHI培养基，BSM固体培养基。

作为优选，步骤1)中所述从阴道分泌物中分离微生物，具体包括以下操作：取阴道分泌物加入至1.5ml无菌的EP管中，用无菌PBS缓冲液按照10¹～10⁶进行倍比稀释，分别以50μL的量涂布于固体培养基中，培养48h。

作为优选，所述阴道分泌物是保存于-80℃环境下且处于甘油环境中的。

作为优选，所述固体培养基包括LB基础培养基，MRS固体培养基，BHI固体培养基，含有5％(g/g)脱脂乳的BHI培养基，BSM固体培养基；其中涂布于MRS固体培养基、LB基础培养基、BSM固体培养基中的样品经过10²～10⁴倍稀释；涂布于BHI固体培养基和含有5％(g/g)脱脂乳的BHI培养基中的样品经过10³～10⁵倍稀释。

作为优选，所述菌种鉴定包括：分别提取若干单菌落中微生物的DNA，经PCR扩增后测序，确定菌种类别。

作为优选，步骤3)具体包括以下操作：

A)取所述若干菌株，分别接种于其所对应的液体培养基中，在CO₂培养箱中于37℃条件下培养至OD值为0.6；

B)将步骤A)所得的若干培养液每种取200μL，各与2mL精液、2mL含有Hela细胞的细胞培养液在15ml离心管中混合，在CO₂培养箱中于37℃条件下培养1～1.5h；

C)固液分离取沉淀，用PBS缓冲液清洗后加入甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察各实验组微生物对精细胞的粘附能力，据此筛选出目标菌株。

作为优选，步骤C)中所述的固液分离是以1000rpm的转速离心；用PBS缓冲液清洗的次数为5次。

作为优选，所述目标菌株包括卷曲乳杆菌，詹氏乳杆菌，格氏乳杆菌，阴道乳杆菌，约氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌或发酵乳杆菌。