[发明专利]快速观察拟南芥胚珠形态及统计外珠被细胞数目的方法

说明书

本发明提供一种快速观察拟南芥胚珠形态及统计外株被细胞数目的方法，其利用荧光漂白剂处理拟南芥的胚珠，在共聚焦显微镜和普通光学显微镜下可以快速及时、快速地对拟南芥胚珠珠被细胞的数目进行统计。相比普通的切片及干涉差‑透明的方法要简便，而且效果更好。

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及一种快速观察拟南芥胚珠形态及统计外珠被细胞数目的方法。

背景技术

胚珠是植物雌性生殖器官，是受精后发育为种子的结构，因此胚珠发育是否正常，直接决定了植物能否形成种子繁衍后代。成熟胚珠由几个特化的部分组成，包括孢子体组织（珠柄、珠被、珠心）和雌配子体组织（胚囊）。裸子植物一般只有一个珠被（integument）结构覆盖珠心形成封闭结构，而被子植物的胚珠通常包括两个珠被结构，即由外珠被和内珠被包裹珠心和胚囊(Kelley and Gasser, 2009)。胚珠受精后，珠被发育成种皮，对保护胚胎、种子传播和种子发芽具有重要作用。而在胚珠发育过程中，珠被发育对胚珠轴向的建立和形态建成具有重要作用。胚珠发育过程中，孢子体和配子体之间存在信号交流，珠被发育缺陷往往导致胚囊裸露或胚囊发育异常，最终影响胚珠的受精而形成败育(Lora et al.,2011; Yadegari and Drews, 2004)。

拟南芥的胚珠很小，而且隐藏在雌蕊的中心，在观察胚珠形态和统计外珠被细胞数目时要先将胚珠外面的组织器官去掉，只留下整个完整的胚珠进行观察。现在国内外常用的方法主要有以 下的几种方法：①电子显微镜扫描的方法：先将组织材料固定在4%（v/v）的戊二醛的磷酸缓冲液（25mM，pH=7.0）中过夜，然后再将样品置于1%的四氧化锇磷酸缓冲液（25mM，pH=7.0）中，在4℃冰箱中放置4-5天，然后再进行电子显微镜扫描，成像后观察胚珠珠被的形状；②透明-干涉观察方法：先将胚珠或者雌蕊固定在（福尔马林:乙醇:乙酸:水=1:0.5:5:3.5）的固定液中过夜，然后将 胚珠放置在含有透明液（水合氯醛:甘油:水=8:1:2）的载玻片上，盖上盖玻片，然后在Olympus显微镜上观察胚珠的形态；③石蜡切片的方法：先用FAA固定液将胚珠或者雌蕊固定，然后用65%到100%系列浓度的乙醇溶液逐级脱水；无水乙醇到纯二甲苯逐级透明；将低熔点的石蜡蜡屑放入盛有1/2二甲苯的小瓶中，直到二甲苯完全饱和；在40℃下浸蜡24h，然后用由混合石蜡在温箱中60℃保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，共72-120h；包埋，进行厚度6-8µm切片，2%明胶粘片，在35℃水浴锅上2h展片，之后再将载玻片放入38℃烘箱中烘干，用纯二甲苯30℃保温脱蜡40min，晾干切片；封片。最后在显微镜底下观察胚珠的形态并且统计外珠被的细胞数目。

但是目前的这几种方法在胚珠形态观察和外珠被细胞数目统计方面，操作起来需要的时间比较长，过程比较的繁琐，同时相对而言效果一般，而且有的方法只能顾及一个方面的效果，如电子显微镜扫描的方法和DIC显微镜观察方法能够看到胚珠和珠被的形态，但是在外珠被细胞数目统计上不占优势。因此，目前还没有一种能够快速有效的观察拟南芥胚珠形态和统计外珠被细胞数目的方法。

发明内容

针对目前还没有一种能够快速、有效地观察拟南芥胚珠形态和统计外珠被细胞数目方法的问题，本发明提供一种快速观察拟南芥胚珠形态及统计外珠被细胞数目的方法，能够快速有效观察拟南芥胚珠形态和统计外珠被细胞数目的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）溶液的配制：配制1‰w/v荧光增白剂溶液和浓度为2M的氢氧化钾的溶液；

（2）材料的获得：取刚要露白的拟南芥花苞放置在贴有双面胶的载玻片上，用注射器的针头挑取拟南芥的胚珠；

（3）玻片制备：吸取1‰w/v荧光增白剂10µL置于载玻片上，将步骤（2）所得胚珠连同胎座置于荧光增白剂液滴上，再加入2M的氢氧化钾溶液10µL，用移液枪轻轻混匀，盖上盖玻片；