[发明专利]一种快速分析微生物多态性动态变化的微型荧光凝胶电泳方法

权利要求书

1.一种快速分析微生物多态性动态变化的微型荧光凝胶电泳方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用引物PCR扩增微生物16S rDNA，引物为27F和1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记，并将PCR产物进行测序，通过与NCBI数据库进行序列比对确定菌种；

(2)利用Hha Ⅰ限制性内切酶切割PCR产物，会产生多条大小不一的片段，每条16S rDNA只有最左端限制性酶切片段具有荧光标记，其它片段没有荧光标记；

(3)利用微型垂直PAGE凝胶电泳分离各个微生物物种的荧光标记片段，最后通过荧光成像系统观察凝胶，根据片段大小、荧光强弱，确定各微生物物种的动态变化。

2.根据权利要求1所述的微型荧光凝胶电泳方法，其特征在于，步骤(1)中，27F的核苷酸序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，M为A或C；1492R的核苷酸序列为：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，Y为C或T。

3.根据权利要求1或2所述的微型荧光凝胶电泳方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增体系：5μl的10×Buffer，4μl的dNTP，1.5μl的27F，1.5μl的1492R，0.25μl的rTaq酶，1μl的DNA模板，用ddH₂O补足至50μl；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环40次；最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1或2所述的微型荧光凝胶电泳方法，其特征在于，步骤(2)中，Hha Ⅰ限制性内切酶酶切反应体系如下：10×buffer 7μl，Hha Ⅰ限制性内切酶0.5μl，PCR产物47μl，ddH₂O 15.5μl；酶切反应条件为：37℃恒温金属浴过夜。

5.根据权利要求1或2所述的微型荧光凝胶电泳方法，其特征在于，步骤(3)中，电泳缓冲液为TBE，电泳条件为100v恒压，2h。

6.根据权利要求1或2所述的微型荧光凝胶电泳方法，其特征在于，电泳凝胶的配方为：蒸馏水5.5mL，30％Acr-Bis 25mL，1M的pH 8.8Tris 19mL，10％过硫酸铵0.5mL，TEMED 0.02mL。