[发明专利]一种快速分析微生物多态性动态变化的微型荧光凝胶电泳方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物多态性动态变化监测方法，特别涉及一种快速分析微生物多态性动态变化的微型荧光凝胶电泳方法。

背景技术

限制性片段长度多态性(RFLP)是微生物多态性分析中重要的分子生物学分子方法。基本原理是对不同的生物种群或微生物类群特定的DNA片段进行限制性内切酶酶切，不同微生物DNA片段中酶切位点不同，产生酶切片段大小和数量不同，通过对酶切DNA片段分析获得微生物多样性结果。RFLP可以检测到酶切位点因DNA变异造成的酶切片段长度的差异，分辨率高，重复性强。通过RFLP的方法进行检测和筛选，简单，成本低廉，高效快速，因此能够大大节约实验成本和时间。关于RFLP技术已有报道，但是利用该技术监测微生物组分动态变化却没报道。目前最常用的检测环境微生物是高通量测序的方法，这种方法需要提供高质量的基因组DNA，而且费用非常昂贵，整个过程比较耗时，而且可重复性比较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速分析微生物多态性动态变化的微型荧光凝胶电泳方法，简单易行，成本低，高效快速，重复性好。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种快速分析微生物多态性动态变化的微型荧光凝胶电泳方法，包括如下步骤：

(1)用引物PCR扩增微生物16S rDNA，引物为27F和1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记，并将PCR产物进行测序，通过与NCBI数据库进行序列比对确定菌种；

(2)利用HhaⅠ限制性内切酶切割PCR产物，会产生多条大小不一的片段，每条16S rDNA只有最左端限制性酶切片段具有荧光标记，其它片段没有荧光标记；

(3)利用微型垂直PAGE凝胶电泳分离各个微生物物种的荧光标记片段，最后通过荧光成像系统观察凝胶，根据片段大小、荧光强弱，确定各微生物物种的动态变化。

作为优选，步骤(1)中，27F的核苷酸序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)，M为A或C；1492R的核苷酸序列为：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)，Y为C或T。

作为优选，步骤(1)中，PCR扩增体系：5μl的10×Buffer，4μl的dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP各2.5mM的混合物)，1.5μl的27F(浓度为10μM)，1.5μl的1492R(浓度为10μM)，0.25μl的rTaq酶(浓度为10U/μl)，1μl的DNA模板，用ddH₂O补足至50μl；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环40次；最后72℃延伸10min。

作为优选，步骤(2)中，HhaⅠ限制性内切酶酶切反应体系如下：10×buffer7μl，HhaⅠ限制性内切酶0.5μl(浓度为10U/μl)，PCR产物47μl，ddH₂O 15.5μl；酶切反应条件为：37℃恒温金属浴过夜。

作为优选，步骤(3)中，电泳缓冲液为TBE，电泳条件为100v恒压，2h。作为优选，电泳凝胶的配方为：蒸馏水5.5mL，30％Acr-Bis(30％为Acr-Bis(质量比为29:1)的混合物质量浓度)25mL，1M的pH 8.8Tris 19mL，10％过硫酸铵(10％质量浓度)0.5mL，TEMED 0.02mL。

本发明的有益效果是：简单易行，成本低，高效快速，重复性好，应用性广，可广泛应用于原核生物的研究。

附图说明

图1是在不同培养条件下生物表面活性剂和石油降解微生物的变化。A，油污微生物在MSM+YE培养基条件下的生长曲线，B，油污微生物在MSM+Glu培养基条件下的生长曲线，C，在MSM+YE培养基条件下，油污微生物件随着时间的变化而发生种类的动态变化，D，在MSM+Glu培养基条件下，油污微生物件随着时间的变化而发生种类的动态变化。

图2是在MSM+YE和MSM+Glu两种培养基条件下积累的优势菌种的生长曲线。A，Alcaligenes CT10，B，Donghicola，C，Bacillus CT6，D，Pseudomonas ZS1。