[发明专利]一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法。

背景技术

博来霉素为广谱抗肿瘤药，对鳞癌，包括头颈部、皮肤、食道、肺、宫颈、阴茎和甲状腺等癌肿以及恶性淋巴瘤等有效，对脑瘤、恶性黑色素瘤和纤维肉瘤等也具有一定疗效。博来霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性的引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞的DNA合成和复制。此外，博来霉素还可以选择性的裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。博来霉素的活性机理决定了其不会抑制骨髓造血系统和免疫系统，因此对人体白细胞，机体免疫功能和造血系统等的副作用较为轻微。博来霉素属于细胞周期非特异性药物，从上世纪80年代其被开发成一种重要的有效抗肿瘤药物，在临床上广泛应用。目前博来霉素一般与其他抗肿瘤药物或辅助药物联合应用，以降低其毒性和获得更好的抗肿瘤效果。

博来霉素自被发现后便因其强效的抗肿瘤活性迅速成为治疗多种肿瘤的特效化疗药物，近年来博来霉素族抗生素在抗病毒研究中的应用，更加拓宽了其应用范围。但是博来霉素导致的剂量依赖性肺纤维化以及一些肿瘤细胞逐渐形成的耐药性极大的限制了其临床应用和推广。因此，合成新型的高效低毒的博来霉素族衍生物一直都是开发博来霉素类抗肿瘤药物的关键和热点。虽然博来霉素的化学合成已经完成，但是通过传统化学修饰获取少量的博来霉素衍生物并未展示出更好的活性和更低的毒性，同时博来霉素及其复杂的分子结构也导致相关的合成过程繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用。为此，我们提出了一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法投入使用，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，以解决上述背景技术中提出的通过传统化学修饰获取少量的博来霉素衍生物并未展示出更好的活性和更低的毒性，同时博来霉素及其复杂的分子结构也导致相关的合成过程繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，该博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法的具体步骤如下：

S1：在轮枝链霉菌菌种的新鲜斜面加入10ml无菌水，刮下白色孢子层后，所得的悬浮液经过滤后振荡2min，制得单孢子溶液；

S2：利用滴定管吸取10ml单孢子溶液于无菌平板中，采用紫外线照射后，将其均匀涂布于无菌平板中培养，制备出耐性菌株；

S3：将耐性菌株接种至含有发酵培养基的三角瓶中，摇瓶发酵；

S4：将发酵后产生的发酵液经过过滤后用微量注射器各取上清液15μL，并滴于圆形层析滤纸小片上，且纸片贴在鉴定菌的培养板上，在37℃环境下培养14～20h，并取抑菌圈较大者进行复筛；

S5：利用HPLC色谱分析方法选取目标产物生产能力较高的菌株，并转接于发酵培养基中，装液量为50mL的三角瓶，在30℃、170r·min^-1的条件下摇床培养60～70h，得到作为发酵培养的种子液；

S6：以10％接种量将所得种子液接种到发酵培养基中进行摇床培养，发酵体系为300mL三角瓶装液量为50mL，在30℃、200r·min^-1的条件下摇床培养6d；

S7：发酵结束后，收集发酵液，用10倍体积甲醇振荡浸提24h后，将甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干后既得。

优选的，所述步骤S2中，在采用紫外线照射时，紫外线发光光源为30W，260A，紫外线光源的照射距离为30cm。

优选的，所述步骤S3中，发酵培养基为淀粉、糊精、大豆粉、葡萄糖、玉米浆、黄豆粉、酵母粉、硫酸铜和硫酸锌的混合物，其PH值为6.5～7.0。

优选的，所述步骤S4中，鉴定菌为枯草杆菌。

优选的，所述步骤S5中，在采用HPLC定量分析中，液相色谱条件为色谱柱YWG，C₁₈，10μm，250×4.6mm。

优选的，所述步骤S7中，真空干燥箱的功率为3～5KW，烘干温度为90～110℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提高了博来霉素的生产周期，进一步的提高其产量，并简化了发酵培养基的成分，降低了生产成本，且制备出的博来霉素能够展现出更好的活性和更低的毒性。

附图说明

图1为本发明制备流程图。

具体实施方式