[发明专利]一种快速检测左旋肉碱的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种快速高效检测左旋肉碱含量的方法，其特征在于，包括：

(1)准备包含冻干乙酰辅酶A和冻干乙酰肉碱转移酶的微孔板A、沉淀剂包被的微孔板B；

(2)在微孔板A上设置标准孔、质控孔、样品孔，先将显色溶液加入各个孔，再将标准品、质控、及待测样品分别加入到相应的微孔中反应，进行酶显色检测，获得其光吸收值OD；

(3)参照步骤(2)在微孔板B同样操作，反应后进行酶显色检测，获得其光吸收值OD_空白；

(4)基于两次酶显色的光吸收值的差值OD-OD_空白，通过构建标准曲线来确定待测样品中左旋肉碱的含量；步骤(1)中，微孔板A的制备过程如下：

(a)乙酰辅酶A溶液的制备

称取20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中，取400μL-600μL与5-50μL甘油和25-100mg D-海藻糖混匀；

(b)乙酰肉碱转移酶溶液的制备

吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，经1500r/min离心10min，弃去上层清液，沉淀用2mL水溶解，取400μL-800μL与5-50μL甘油和25-100mg D-海藻糖混匀；

(c)冻干处理

在微孔板的微孔中加入5-10μL乙酰辅酶A溶液和5-10μL乙酰肉碱转移酶溶液，并将该含乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板放入-80℃下预冻30-60min，之后于冻干机中-70～-80℃下冻干6～8h，使乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶得以固定并干燥于微孔中，获得微孔板A，将其置于低温干燥条件下保存备用；

其中，待测样品制备方法为：

准确称取1.0g混合均匀的试样于烧杯中，用5-10mL水在35-45℃溶解，加入2mL 13％高氯酸溶液，混合均匀后放置5-10min，使试样中的蛋白质变性沉淀，用蒸馏水定容至20mL，混匀，离心；取滤液0.8mL，加入0.08mL 4mol/L氢氧化钾溶液置于35-45℃水浴震荡10-15min，使结合态的左旋肉碱游离出来；冷却后用13％高氯酸调节pH为6.0～8.0，加入15-30μL氯化钙，加水至2mL，混匀后4000-15000rpm离心，取上清液检测，最后上清液一定要保证澄清，按该过程，样品稀释倍数为50倍；或者

取试样5.0g，用温水溶解样品并转入50mL容量瓶中后加入5-15mL质量分数为3.6％的亚铁氰化钾、5-15mL质量分数为7.2％的硫酸锌以及15-30mL 100mM NaOH溶液，每次加入都要混匀，最后定容，混合，过滤，取滤液检测；或者

称取5.0g试样于三角瓶中，加入20-40mL 0.1mol/L HCl，超声提取15-30min，用4％NaOH将pH值调至7.0～7.5，转入50mL容量瓶中定容后混匀，用滤纸过滤或离心后取滤液检测；

步骤(2)中，显色溶液的配置方法如下：分别称取50mg 2-硝基苯甲酸、5.96g N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中，用10mol/L NaOH溶液调pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL，5倍稀释使用；

步骤(2)中，设置7个标准孔，左旋肉碱标准品配制浓度分别为：0、1.6、3.2、6.4、9.6、16、22.4μg/mL。

2.根据权利要求1所述的检测左旋肉碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)中的酶显色检测均采用酶标仪在波长410-420nm测试吸光度；以二者的吸光度差作纵坐标，浓度值为横坐标，作标准曲线，从标准曲线中读出样品浓度，所得浓度乘以稀释倍数为待测样品中最终所含左旋肉碱浓度。