[发明专利]一种快速检测左旋肉碱的方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速高效检测左旋肉碱含量的方法及试剂盒，该方法包括：准备包含冻干乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板A、包含沉淀剂包被的微孔板B；在微孔板A上设置标准孔、质控孔、样品孔，先将显色溶液加入各个孔，再将标准品、质控、及待测样品分别加入到相应的微孔中反应，进行酶显色检测，并测定其光吸收值(OD)；参照微孔板A在微孔板B同样操作，反应后进行酶显色检测，并测定其光吸收值(OD_空白)；基于两次酶显色的光吸收值的差值(OD‑OD_空白)，通过构建标准曲线来确定待测样品中左旋肉碱的含量。本发明减少了检测过程中试剂的配制，操作更简便，酶活力能稳定保持，检测结果更可靠，方法检出限达1mg/100g。

技术领域

本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种快速检测左旋肉碱的方法及其试剂盒。

背景技术

左旋肉碱又称L-肉碱，是一种促使脂肪转化为能量的内氨基酸，红色肉类是左旋肉碱的主要来源，对人体无毒副作用，左旋肉碱也是条件性婴儿必需的营养物质，在婴儿利用脂肪作为能量来源的代谢中起重要作用。左旋肉碱在婴幼儿食品、饮料、饼干以及一些减肥产品中普遍存在。目前文献报道中测定左旋肉碱的方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法和质谱分析法等，但分光光度法仍是最主要的检测方法。分光光度法检测左旋肉碱大多需要先发生一步化学反应，例如样品中游离的左旋肉碱在乙酰肉碱转移酶的催化作用下与乙酰辅酶A反应，生成游离的辅酶A，辅酶A被进一步氧化后产生有色物质或具有紫外吸收的物质，颜色深浅与左旋肉碱的含量成正比，进而间接检测游离的左旋肉碱的含量。

国标GB 29989中对婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的检测原理和方法做了明确规定，主要采用比色法，测试样经过水提取，用高氯酸沉淀蛋白质后过滤，滤液经碱皂化后，结合态的左旋肉碱游离出来，左旋肉碱与乙酰辅酶A在乙酰肉碱转移酶的催化下反应生成乙酰肉碱和游离的辅酶A。游离的辅酶A和2-硝基苯甲酸反应生成黄色物质，其颜色深浅与游离的辅酶A含量成正比。因游离的辅酶A与左旋肉碱是等摩尔反应关系，可间接求出试样中左旋肉碱含量。目前国标法检测左旋肉碱含量，采用紫外分光光度计，主要有以下几个方面的缺点：(1)乙酰辅酶A和肉碱乙酰转移酶费用昂贵，检测成本很大；(2)所耗费的体积较大，采用传统比色皿进行测试，需要2-3mL体积的用量，在比色阶段比较耗时；(3)所用到的酶以水溶液形式保存，其有效期有限，酶活力会受到很大程度影响，严重影响实验的稳定性；(4)样品处理需要称量5g，后期样品处理消耗试剂量大，在对某些基质处理上不能透明，影响后续的检测效果。发明专利申请(CN 106198531A)：检测左旋肉碱含量的方法：将待测样品与显色液和乙酰辅酶A进行第一接触和第一酶标检测；将第一接触后样品与肉碱乙酰转移酶进行第二接触和第二酶标检测；以及基于第二酶标检测与第一酶标检测的差值，确定待测样品中左旋肉碱的含量。

国标GB 29989中，样品处理方法复杂、耗时长，并且试剂用量大，检测过程繁琐，重复性差；而现有的左旋肉碱检测试剂盒试剂配制和保存繁琐，反应体系复杂。发明专利申请CN 106198531A实际上就是GB29989检测体系的缩小版，改变试剂的用量实现在酶标板上的检测，在技术上没实质创新，仍不能解决酶的保存有效期和实验稳定性问题。

BioVision及Sigma等公司已有针对左旋肉碱的检测试剂盒，其原理是将一个乙酰基团从乙酰辅酶A转运到肉碱上，生成的游离辅酶A随后参与到Oxi-Red探针的氧化过程，使其发出荧光，并用酶标仪读取在570nm处的吸收峰，目前市场上存在的试剂盒大多基于该原理。

发明内容

为了克服现有方法的不足，可以快速高效地检测试样中的左旋肉碱含量，本发明提供快速检测左旋肉碱的方法及试剂盒，不仅能大大缩短试样中左旋肉碱的提取时间，避免了复杂的反应体系，减少在微孔板中的加样步骤，而且使用酶标仪可以快速批量地检测试样中左旋肉碱的含量。

首先，本发明提供一种快速检测左旋肉碱的方法，包括：

一种快速高效检测左旋肉碱含量的方法，其特征在于，包括：