[发明专利]一种用于角膜疾病治疗的上皮细胞片的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及组织工程口腔黏膜上皮细胞片的制备方法。具体地，本发明提供一种口腔黏膜上皮细胞片的制备方法，包括以下步骤：(a)口腔黏膜组织采集步骤；(b)口腔黏膜上皮细胞提取步骤；(c)口腔黏膜成纤维细胞提取步骤；(d)上皮细胞培养基质和培养支架制备步骤；(e)口腔黏膜上皮细胞与口腔黏膜成纤维细胞共培养步骤；以及(f)制备得到的上皮细胞片与同培养材料的分离步骤。

技术领域

本发明涉及组织工程与生物制品领域，具体地，本发明涉及一种用于角膜疾病(尤其是角膜眼表疾病)治疗的上皮细胞片的制备方法及其应用。

背景技术

人的眼角膜共分5层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。上皮细胞层是最外面的一层，厚度约为50微米，占整个角膜厚度的10％，由5-6层细胞所组成。角膜周边部上皮增厚，细胞层数增加到8-10层。角膜上皮共有3种类型的细胞：基底细胞、翼状细胞、扁平细胞。上皮细胞间以桥小体相接，构成致密的质膜，这层致密坚固的屏障可阻止大部分微生物的侵入，阻止泪液中液体和电解质进入基质层，使得角膜处于相对脱水状态。由于外界原因和/或自身原因角膜上皮层会发生各种损伤和/或病变，情况严重导致失明。

化学伤、热灼伤或其他疾病(例如，Steven-Johnson、眼天疱疮等)可导致眼表损伤，破坏角膜上皮的结构和功能。目前，目前临床治疗主要依赖于异体角膜移植，但供体材料来源有限等困难严重制约了这一治疗方法的应用。而且，异体角膜移植仍然存在术后免疫反应，甚至出现供体排斥而致手术失败。

此外，现有治疗方法还包括人工角膜移植。目前，已有多种人工角膜应用于临床，但其材料均达不到理想要求。而且，由于人工角膜的晚期并发症：角膜溶解、植入物排出、房水渗漏、眼内炎、人工角膜后增生膜、青光眼等，目前仅适用于常规角膜移植失败的双眼角膜混浊性失明患者，一般只作为最后的选择。

还可采用的另一种治疗方法是：羊膜移植。人羊膜可作为基底膜、促进上皮细胞增殖和分化以及抗炎症抗粘连等用于眼表疾病的治疗，但羊膜是来源于异体组织，难免会带来供体的相关物质，其安全性值得考虑。

最近新起的一种治疗方法是：生物角膜移植，生物角膜虽然可以解决供体紧张及人工角膜缺陷的一些问题，但其来源是异种属，难以避免排异反应，其安全性值得考虑。

随着组织特异性干细胞知识的不断深入以及组织工程技术的飞速发展，自体角膜缘干细胞体外培养形成细胞片，用于眼表损伤的重建取得令人满意的临床效果。但是对于双眼眼表损伤的患者，因没有健康的角膜缘组织可供取材，故无法开展。

因此，本领域迫切需要一种更佳的角膜损伤治疗方法，既能解决供体不足的问题，同时也能避免异体移植可能发生的排斥反应以及长时间使用糖皮质激素和免疫抑制剂带来的一系列不良反应，从而为LSCD患者提供了个体化可行性治疗方案。

发明内容

在本发明的一方面，提供了一种口腔黏膜上皮细胞片的制备方法，包括以下步骤：

(a)口腔黏膜组织采集步骤；

(b)口腔黏膜上皮细胞提取步骤；

(c)口腔黏膜成纤维细胞提取步骤；

(d)上皮细胞培养基质和培养支架制备步骤；

(e)口腔黏膜上皮细胞与口腔黏膜成纤维细胞共培养步骤；以及

(f)制备得到的上皮细胞片与同培养材料的分离步骤。

在本发明一些优选的实施方式中，所述步骤(b)中口腔黏膜上皮细胞采用Ⅰ型中性蛋白酶联合胰蛋白酶进行消化。

在本发明一些优选的实施方式中，所述步骤(c)中口腔黏膜成纤维细胞采用经Ⅰ型中性蛋白酶消化后的结缔组织块贴附培养法培养提取。