[发明专利]氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种基因工程菌，其特征在于，其是将重组表达载体转化入受菌体构建而成；所述重组表达载体中包含由目的蛋白的基因、连接肽的基因与自聚集短肽的基因连接而成的基因片段；所述目的蛋白为单加氧酶或脱氢酶。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述单加氧酶为环己酮单加氧酶；较佳地，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5；所述环己酮单加氧酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6；

和/或，所述脱氢酶为酮还原酶，较佳地为异丙醇脱氢酶；更佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11；最佳地，所述酮还原酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.13；较佳地，编码所述连接肽的核苷酸序列为SEQ ID NO.14；

和/或，所述自聚集短肽包括18A、R18A、ELK16、EAK16或L6KD；所述18A的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；较佳地，编码18A的核苷酸序列为SEQ ID NO.16。

4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组表达载体所采用的质粒为pET21a、pET28a或pET30a；

和/或，所述受菌体为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌BL 21star(DE3)或大肠杆菌BL 21(DE3)plyss。

5.一种如权利要求1-4任一项所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，按本领域常规的构建方法构建所述重组表达载体，再将所述重组表达载体转化入受体菌，即得。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)按所述目的蛋白的基因-所述连接肽的基因-所述自聚集短肽的基因的连接顺序，构建得到所述重组表达载体；

(2)将所述重组表达载体转化入受体菌，即得所述基因工程菌。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建方法为：1)将所述连接肽与自聚集短肽的基因连接，得基因片段I，然后在所述基因片段I的两端加上内切酶片段，利用酶切位点将所述基因片段I插入质粒；2)在所述目的蛋白的基因两端加上内切酶片段，利用酶切位点将所述目的蛋白的基因插入所述质粒，即可；

步骤1)中，所述内切酶片段较佳地为HindIII和XhoI内切酶片段；和/或，步骤2)中，所述内切酶片段较佳地为Nde I和HindIII内切酶片段。

8.一种氧化还原酶的融合蛋白，其特征在于，其由依次连接的目的蛋白、连接肽和自聚集短肽组成；所述目的蛋白为权利要求1-4任一项中所述的目的蛋白；所述连接肽为权利要求1-4任一项中所述的连接肽；所述自聚集短肽为权利要求1-4任一项中所述的自聚集短肽。

9.一种如权利要求8所述氧化还原酶的融合蛋白的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：将如权利要求1-4任一项所述基因工程菌进行活化培养，然后接种到发酵培养基，发酵培养，加入诱导剂进行诱导表达，即得；

其中，所述活化培养较佳地为：将所述基因工程菌接种到液体LB培养基中，于35-37℃下摇床活化8-12小时；

其中，所述发酵培养基较佳地为LB培养基；所述发酵培养的接种量较佳地为0.5％-5％，百分比为活化培养后的培养物相对于发酵培养基的体积比；所述发酵培养的温度较佳地为25-40℃；所述发酵培养的时间较佳地为1-3小时；

其中，所述诱导剂；较佳地为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷和/或乳糖；所述诱导剂的浓度较佳地为0.05-2g/L。

其中，所述诱导表达的温度较佳地为15-35℃；所述诱导表达的时间较佳地为2-24小时。

10.如权利要求8所述氧化还原酶的融合蛋白在酶法合成埃索美拉唑中的用途；

所述目的蛋白为单加氧酶，所述氧化还原酶的融合蛋白作为催化剂使用；和/或，所述目的蛋白为脱氢酶，所述氧化还原酶的融合蛋白作为辅助组分使用。