[发明专利]氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途。该基因工程菌是将重组表达载体转化入受菌体构建而成；重组表达载体中包含由目的蛋白的基因、连接肽的基因与自聚集短肽的基因连接而成的基因片段；目的蛋白为单加氧酶或脱氢酶。本发明的基因工程菌能够产出氧化还原酶的融合蛋白，其能够在酶法合成埃索美拉唑中作为催化剂和/或辅助组分使用，其不仅能大大提高催化反应速度，提升埃索美拉唑的产量，还能够减少后处理过程中杂质的含量及种类。本发明的氧化还原酶的融合蛋白的热稳定性好，对催化条件的适应性和稳定性好，大幅降低了生产成本，具有优越的工业化应用价值。

技术领域

本发明涉及一种氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途。

背景技术

埃索美拉唑生物酶法合成具有反应收率高，产物手性选择性较好，且无需重金属手性配体的优势。科德克希斯(拉唑化合物的合成，CN201080054980.3)开发了一种单加氧酶，可在两相进行催化反应，单次可转化的底物浓度为33g/L，但不适合工业化大规模生产。另外，CN201410695734.6公开了一种环己酮单加氧酶及其在合成埃索美拉唑中的应用，其反应收率较高，但是反应底物浓度和单次产量仍然很低，无法满足工业化生产的需要。

CN201611236175.8中公开了一种采用一锅法催化制备埃索美拉唑的方法，其催化底物浓度可达100g/L。然而，当反应过程中使用共表达的环己酮单加氧酶和酮还原酶的全细胞作为催化剂，会发现在催化反应结束之后，反应的后处理过程十分繁琐，全细胞中含有大量杂蛋白和其他杂质，这使得后处理的成本占到整个工艺成本的50％左右。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于克服当前酶法催化合成埃索美拉唑时，后处理过程十分繁琐，后处理成本过高等缺陷，提供一种氧化还原酶的融合蛋白、产其的基因工程菌及其制备方法和用途。所述氧化还原酶的融合蛋白能够在酶法合成埃索美拉唑中作为催化剂或辅助组分使用，其不仅能大大提高催化反应速度，提升埃索美拉唑的产量，还能够减少后处理过程中杂质的含量及种类；此外，所述氧化还原酶的融合蛋白的热稳定性好，对催化条件的适应性和稳定性好，大幅降低了生产成本，具有优越的工业化应用价值。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供了一种基因工程菌，其是将重组表达载体转化入受菌体构建而成；所述重组表达载体中包含由目的蛋白的基因、连接肽的基因与自聚集短肽的基因连接而成的基因片段；所述目的蛋白为单加氧酶或脱氢酶。

其中，所述单加氧酶可为本领域常规的单加氧酶，较佳地为环己酮单加氧酶。按本领域常识，所述环己酮单加氧酶的基因一般来自于Lysinibacillus sp.、Ustilago sp.、Arthrobacter sp.、Brevibacterium sp.、Acinetobacter sp.、Mycobacterium sp.、Aspergillus sp.或者Cunninghamella sp.。在本发明中，较佳地，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5。更佳地，所述环己酮单加氧酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6。

其中，所述脱氢酶可为本领域常规的脱氢酶，较佳地为酮还原酶(又称醇脱氢酶)，更佳地为异丙醇脱氢酶。按本领域常识，所述酮还原酶的基因一般来自于Lactobacillussp.、Yarrowia lipolytica sp.或者Gluconobacter oxydans。较佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11，优选为SEQ ID NO.7。更佳地，所述酮还原酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12，优选为SEQ IDNO.8。