[发明专利]高危人乳头瘤病毒试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生命科学和技术领域，特别涉及人类乳头瘤病毒HPV的检测。

背景技术

人乳头瘤病毒即HPV，高危HPV持续感染(HR-HPV)是宫颈癌发生的最主要原因，其中HR-HPV E6和E7基因是促进宫颈癌发生发展的最主要的癌基因。目前的研究表明：不同的高危HPV亚型引起宫颈癌的致癌能力不同，其中HPV16和18亚型是公认的致癌能力最强的亚型。因此，通过检测妇女宫颈上皮组织感染的高危HPV亚型对预测宫颈癌的发生具有重要的作用。最新的宫颈癌筛查指南也建议高危HPV分型检测方法作为一线的宫颈癌筛查方法。目前，报道的HPV检测方法超过125种，按技术原理主要分为杂交法，实时定量PCR法，高分辨溶解曲线法，第二代杂交捕获法，焦磷酸测序法，PCR-飞行质谱技术和荧光标记PCR法。其中，仅实时定量PCR法，高分辨溶解曲线法和荧光标记多重PCR法操作简单，时间短，仅需一步就可得到可用于检测的扩增子。然而，实时定量PCR法通量较低，成本高；高分辨溶解曲线法准确性低限制了在亚型多样的HPV检测中的应用。荧光标记多重PCR结合毛细管电泳具有成本低，通量高，准确性高的优点，弥补了实时定量PCR和高分辨溶解曲线法的不足之处。

荧光标记多重PCR的原理是针对不同的基因区域设计不同的荧光标记引物，即每一对引物中的一条引物标记上荧光基团，通过多重PCR扩增得到不同荧光和不同长度的扩增子。扩增子进行毛细管电泳来区分，已达到分型的目的。

浦艳等建立了基于荧光标记PCR方法检测人乳头瘤病毒核酸检测方法可同时对24种HPV亚型进行分型检测，操作简单，通量高，灵敏度较高。但是，浦艳等的发明有以下几个不足之处：(1)由于HPV整合进入人基因组的过程容易导致HPV L1基因缺失，导致对宫颈癌及癌前病变的筛查灵敏度下降。(2)由于L1基因是HPV亚型间最保守的基因，可能导致对HPV分型的特异性降低。(3)简并引物的引入，降低了本方法对HPV分型的特异性。(4)PCR扩增过程中需要两种酶Taq HS DNA聚合酶和UNG酶，增加了检测试剂成本。(5)其方法在PCR完成后，为了获得单链的荧光标记产物进行了变性，然后进行毛细管电泳，增加了检测成本。

戴建荣等建立了基于荧光标记PCR方法检测人乳头瘤病毒E6/E7基因区域的方法，可同时对22种HPV亚型进行分型。与浦艳等的方法相比，在灵敏度和特异性方面有所提高，降低了成本；并且本方法针对HPV E6/E7基因区域进行分型，可能提高对宫颈癌及癌前病变的筛查灵敏度。但是，以上两种发明方法都需要对检测的每一种HPV亚型设计特异性的荧光标记引物，成本随着检测HPV亚型的增多成线性增加。

发明内容

为了进一步降低荧光标记多重PCR的费用，并且解决HPV亚型的增多与检测成本线性增加的问题，我们在多重PCR体系中引入了通用的荧光标记引物，只需设计三种荧光标记引物，就能够扩增出十几种不同长度或不同荧光的扩增子。

根据本发明的一方面提供了一种高危人乳头瘤病毒检测试剂盒，包括HPV扩增引物，所述HPV扩增引物为HPV16上游引物及HPV16下游引物、HPV18上游引物及HPV18下游引物、HPV31上游引物及HPV31下游引物、HPV33上游引物及HPV33下游引物、HPV35上游引物及HPV35下游引物、HPV39上游引物及HPV39下游引物、HPV45上游引物及HPV45下游引物、HPV51上游引物及HPV51下游引物、HPV52上游引物及HPV52下游引物、HPV56上游引物及HPV56下游引物、HPV58上游引物及HPV58下游引物、HPV59上游引物及HPV59下游引物、HPV66上游引物及HPV66下游引物和HPV68上游引物及HPV68下游引物，

HPV16上游引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

HPV16下游引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

HPV18上游引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；

HPV18下游引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；

HPV31上游引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；

HPV31下游引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；

HPV33上游引物如序列表中SEQ ID NO.7所示；

HPV33下游引物如序列表中SEQ ID NO.8所示；

HPV35上游引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；

HPV35下游引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；

HPV39上游引物如序列表中SEQ ID NO.11所示；