[发明专利]双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法

说明书

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法。所述试剂盒包括：(1)第一发卡结构DNA探针，能够与所述miRNA碱基配对，从而打开发卡结构；(2)第二发卡结构DNA探针，能够与miRNA竞争结合第一发卡结构DNA探针，从而释放miRNA，并且，第二发卡结构DNA探针与第一发卡结构DNA探针形成的DNA复合体具有至少一个粘性末端；(3)环状DNA探针，其中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到G四联体扩增产物。利用本发明的试剂盒和方法对miRNAs进行测定，操作简便，成本低，灵敏度高，特异性好。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地，涉及一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是存在于真核细胞中的一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA，长约18-24nt。miRNAs通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’UTR)互补结合，在翻译水平上特异性抑制或沉默基因的表达，因此miRNAs广泛参与了生物体多种生理过程，如个体发育、细胞增殖、分化和凋亡、代谢与应激反应的调节，甚至疾病的发生，包括肿瘤形成。miRNAs还参与了肿瘤细胞重要的生物程序调控，间接地起着促癌基因和抑癌基因的功能，在肿瘤的发生和发展中起了至关重要的作用，因此miRNAs被视为肿瘤早期诊断、预后和治疗的重要潜在生物标记物和靶标。

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)是借鉴自然界中环状DNA分子滚环式的扩增机制发展起来的一种信号放大的检测方法。RCA是一种等温信号扩增方法，可在室温下进行，使用两个引物就可实现指数滚环扩增，可用于极微量生物标记物的检测。

硫黄素T(Thioflavin T，ThT)是一种商业化的水溶性苯并噻唑荧光染料，以前常用于淀粉体的检测，近些年有研究发现，ThT可专一性的与DNA/RNA的G-四联体结合并显著增强其荧光强度，而不能与DNA/RNA的其它结构(三联体、二联体和单链)结合，因此可以显著降低检测背景。

miRNAs具有短序列、高同源、低含量和极易降解的特性，因此在生物医学研究和早期临床诊断方面急需高效，特异的miRNAs检测方法。

传统的miRNAs的检测方法主要有Northern blot，微阵列和实时定量PCR(real-time PCR)，这些检测方法不仅需要使用大型昂贵的仪器设备，操作繁琐，而且灵敏度低，特异差，因此很难普及。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的上述缺陷，提供一种操作简单、灵敏度高、特异性好和成本低的双向信号扩增特异性检测循环microRNA的方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒，该试剂盒包括：

(1)第一发卡结构DNA探针，所述第一发卡结构DNA探针能够与所述miRNA碱基配对，从而打开发卡结构；

(2)第二发卡结构DNA探针，所述第二发卡结构DNA能够与miRNA竞争结合所述第一发卡结构DNA探针，从而释放miRNA，并且，所述第二发卡结构DNA探针与所述第一发卡结构DNA探针形成的DNA复合体具有至少一个粘性末端；

(3)环状DNA探针，所述环状DNA探针中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，所述环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到含有多G重复序列的G四联体扩增产物。

优选地，所述试剂盒还包括：(4)ThT荧光染料。

根据本发明，所示粘性末端的长度优选为10-20nt。

所述ThT荧光染料(Thioflavin T)的结构如式I所示。其合成方法已为本领域技术人员公知。也可商购获得。