[发明专利]真核表达制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种可高效表达且表达产物具有明显生物学活性的真核表达制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法。

背景技术

红鳍东方鲀是国内养殖出口鱼类的主要品种。但在养殖中经常会有白嘴病、真鲷虹彩病毒病等病毒性疾病以及弧菌病、链球菌病等细菌性疾病发生，降低了成鱼产量，进而增加了养殖成本。因此，如在红鳍东方鲀养殖过程中提高鱼体自身免疫机能既可以保证鱼体食用安全性，又可避免化学药物对环境造成的污染。

细胞因子是鱼类免疫系统中的重要成员，行使特异性和非特异性的免疫防御，能够调节细胞的分化并诱导细胞发挥相应的功能，白介素2（interleukins-2,IL-2）是一类能够在免疫细胞和白细胞之间相互作用的细胞因子，主要由活化的Ｔ淋巴细胞分泌。研究表明IL-2与含有α，β，γ三条链的复杂受体IL-2R结合后触发胞内信号反应，从而在Ｔ淋巴细胞、Ｂ淋巴细胞和自然杀伤细胞的复制与分化过程中发挥重要作用。2001年开始，鱼类白介素2的研究广泛展开，徐炳森等从草鱼头肾淋巴细胞中提取RNA并反转录为cDNA，以高等动物和牙鲆的IL-2基因两端的保守序列为依据设计合成引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，并将其克隆入PET-28载体后在大肠杆菌中进行表达。2002年第一条草鱼IL-2基因登陆Genebank数据库和2005年成功克隆日本河豚IL-2基因更加坚定了人类探索鱼类IL-2基因的信心。至2014年，草鱼、鳟、绿河豚、红鳍东方鲀、三刺鱼、虹鳟、鲈鱼等白介素2基因序列均已登陆Genebank，且其中已有部分被成功克隆，但是红鳍东方鲀白介素2基因在真核细胞中表达的研究还未有报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的技术问题，提供一种真核表达制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法。

本发明的技术解决方案是：一种真核表达制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因，其特征在于所述基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

一种真核表达制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 将DNA序列如SEQ ID NO:1所示的基因克隆入真核表达质粒pPICZαA上，得到真核表达重组质粒pPICZαA-IL-2；

b. 将得到的真核表达重组质粒pPICZαA-IL-2电转化入毕赤酵母GS115感受态中，筛选阳性克隆；

c. 将筛选出的阳性克隆接种到BMGY液体培养基内扩大培养至OD_600nm=2~6，离心收集菌体；

d. 用无菌水重悬所收集的菌体，使OD_600nm=1.0~2.0，离心后收集菌体； BMMY液体培养基重悬菌体后转接至100mL含BMMY液体培养基的锥形瓶中，使OD_600nm=1.0~2.0；28~30℃、250~300 rpm震荡培养96h，期间每24h向培养基中添加甲醇至终浓度为1.5%；12000rpm，4℃离心3min收集上清，PBS缓冲液透析，3KD超滤管浓缩，75%硫酸铵沉淀法再次浓缩上清中的蛋白，收集沉淀，即得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白。

本发明是在天然红鳍东方鲀白介素2基因的基础上进行密码子优化，并在序列两端加入酶切位点等，继而以改造的基因真核表达制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白，与现有技术相比，具有如下优点：（1）能够在毕赤酵母中高效表达，表达量占菌体总蛋白的80%以上；（2）所表达的重组红鳍东方鲀白介素2蛋白主要分泌到毕赤酵母细胞外的培养基中，不需要超声破碎等繁琐操作就可以得到重组红鳍东方鲀白介素2蛋白，且其稳定性好，可重复性高，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1是本发明实施例重组质粒的双酶切电泳鉴定图。

图2是本发明实施例不同甲醇浓度所诱导的重组蛋白表达的电泳图。

图3是CTLL-2细胞在红鳍东方鲀白介素2标准品作用下的增值曲线图。

图4是 CTLL-2细胞在本发明实施例重组蛋白作用下的增值曲线图。

具体实施方式

本发明是在天然红鳍东方鲀白介素2基因的基础上针对毕赤酵母密码子的偏爱性进行密码子优化，并在序列N端添加XhoⅠ及kex 2蛋白酶切位点，C端保留终止密码子并添加XbaⅠ酶切位点。优化的基因DNA序列如SEQ ID NO:1所示，用于真核表达制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白。