[发明专利]一种天然组织来源的半月板脱细胞材料及其制备方法

说明书

技术领域

本发明主要涉及用于组织或器官修复及其再生的生物领域，具体是一种天然组织来源的半月板脱细胞材料及其制备方法。

背景技术

半月板在膝关节中承担着重要的生物力学作用，其损伤在临床上十分常见，往往引起严重的功能缺失，半月板退变以及关节炎症，难以自愈。在美国，每150万台膝关节手术中就有一半与半月板损伤相关，花费巨大。目前此类手术多为同种异体半月板置换术，但是免疫排斥反应强烈，生物力学性能欠佳，效果并不理想。

再生医学和组织工程技术的出现使根治半月板损伤成为可能。它由三种重要的因素构成包括细胞，支架以及生物活性分子。由细胞支架构建的材料在组织工程中应用极为广泛，例如天然的聚合物材料，合成的胶原或蛋白支架，金属材料等，但是它们难以完全模拟半月板的生理特性以及力学性能，限制了修复的效果。

天然组织来源的细胞外基质(ECM)能够在去除诱导免疫排斥的细胞的同时，保留天然的3D微结构以及细胞外基质中的有效成分包括胶原，糖胺聚糖(GAG)，细胞因子等，为修复半月板缺损提供了可能。而目前性能良好的半月板脱细胞材料尚未被发现。

发明内容

本发明针对现有的填补现有技术中，半月板在材料组成、结构、生物力学方面的不足以及半月板缺损的修复效果，提供一种适宜的治疗半月板缺损的半月板脱细胞材料的制备方法。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：将哺乳动物任意半月板组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞半月板材料；

所述的含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液质量浓度为1％-5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；

所述的有机溶剂溶液为等体积比的三种溶液，氯仿和甲醇溶液、质量浓度10％-100％的丙酮溶液或质量浓度30％-70％的乙醇溶液；

所述的含Triton X的PBS缓冲液的质量浓度1％-5％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；

所述的含SDS的PBS缓冲液的质量浓度0.5％-5％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-20mmol/L的Tris；

所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶质量浓度为0.01-0.5mg/ml。

一种天然组织来源的半月板脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

(1)取哺乳动物全身任意半月板组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、毛发和韧带；

(2)接着在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床100rpm震荡8-24小时；

(3)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床100rpm震荡脱脂2-12小时；

(4)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡4-15天；

(5)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡2-8天；

(6)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡2-12小时；

(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡72小时，即得天然组织来源的半月板脱细胞材料；

混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1；步骤(4)-(6)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1；

步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。

针对目前用于半月板修复和再生的骨材料及其制备方法存在的问题，发明人建立了一种天然组织来源的半月板脱细胞材料的制备方法，该法将哺乳动物任意半月板组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得半月板脱细胞材料。

相对于现有技术，本发明的显著进步在于：

(1)本发明所采用的半月板是天然来源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材广泛性。

(2)本发明运用一种脱细胞方案即可同时实现对任意物种半月板组织进行彻底去细胞化处理，更加高效便捷的获得均一性高的脱细胞半月板材料。