[发明专利]一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用。本发明采用还原胺化法在糖分子的还原端引入含氨基分子，再将含有氨基的糖分子与含有羧基的荧光分子偶联，分别采用透析和凝胶过滤方法对还原胺化及荧光标记后产物进行纯化，最终获得荧光标记的糖分子。本发明制备的荧光标记糖分子在活体动物中用于糖分子的代谢动力学及组织和器官分布研究。本发明提供的糖分子荧光标记方法操作简单，具有重复性好，适用范围广，成本低廉等优点，可用于任何含有还原末端的糖分子的标记，并采用活体成像仪研究其在动物体内的代谢和组织器官分布。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用。

背景技术

糖类化合物尤其是多糖由于结构复杂，没有特定的紫外吸收光谱，使得糖类药物的微量检测成为难点，进而限制了糖类分子体内药代动力学研究并成为糖药物开发的瓶颈。传统的糖类药物代谢动力学研究方法有同位素标记法、免疫学法、色谱分析法等，由于过程繁琐，灵敏度低，结果重复性差而受到限制。

荧光标记及活体成像检测技术由于灵敏度高，检测结果直观，已广泛用于生命科学研究及药物开发中。研究表明，Cy7可对姜黄素进行荧光标记，并利用活体成像技术对姜黄素在小鼠体内分布情况进行实时检测，表明该技术可对姜黄素在小鼠体内代谢进行研究(孙永等，南京中医药大学学报，2011，27(6): 539-541)。但是，对于糖类化合物是否能采用类似技术进行荧光标记，并研究其在活体内的药代动力学特点及组织和器官分布尚无专利或文献报道。

发明内容

针对糖类分子体内代谢和组织器官分布研究方法不灵敏问题，本发明的目的在于提供一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用，本发明为糖类分子提供了简单的荧光标记技术，并利用活体成像技术检测荧光标记糖分子在活体动物体内的代谢动力学及组织器官分布，弥补了现有技术存在的不足之处。所提供的荧光标记及纯化方法简单，效率高，荧光信号强，检测灵敏度高，并且结果直观可视性好，尤其是对于未知结构的糖分子代谢研究更具有明显的优势，易在糖类药物开发及临床研究中应用。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种荧光标记的糖分子，所述荧光标记的糖分子经过如下标记过程获得：

其中所述R为多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，n=2-10，所述荧光分子为N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的花青染料Cy3、Cy5和Cy7中的至少一种。

本发明还提供了所述的荧光标记的糖分子的制备方法，它包括以下步骤：

(1)还原胺化：将糖分子溶解在含有二氨基试剂的乙酸溶液中，再加入还原剂，形成反应体系，搅拌反应5h～24h，反应结束后用1kDa～10kDa透析袋透析，透析液减压浓缩后冷冻干燥，得到糖分子还原胺化产物；

(2)荧光标记：将步骤(1)糖分子还原胺化产物用磷酸盐缓冲液溶解后加入荧光标记试剂形成总反应溶液，避光反应，对糖分子进行荧光标记，获得所述荧光标记的糖分子。

进一步的：所述步骤(1)中二氨基试剂为1,5-戊二胺、1,6-己二胺、1,7-庚二胺、1,8-辛二胺、1,9-辛二胺和1,10-壬二胺中的至少一种，所述二氨基试剂在反应体系中的摩尔浓度为糖分子在反应体系中摩尔浓度的10～200倍。

进一步的：所述步骤(1)中加入的还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化锂、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、吗啉硼烷和4-甲基吗啉硼烷中的至少一种，所述还原剂在反应体系中的摩尔浓度为糖分子在反应体系中摩尔浓度的10～200倍。

进一步的：所述步骤(2)中荧光标记试剂在总反应溶液的最终摩尔浓度为糖分子在总反应溶液摩尔浓度的2～10倍。