[发明专利]一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法

权利要求书

1.一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法，其特征在于，所述方法操作如下：将表面消毒后的野生蔷薇植物组织剪碎，置于预冷研钵中加液氮覆盖，用力充分研磨至细粉末状，称取研磨后的粉末置于预热后的CTAB混合液中，研磨至粘稠状混合物，混合物涡旋混匀后，加入试剂盒中的Solution C1，上下颠倒数次混匀，涡旋振荡、离心后将上清液转移到新的收集管中，加入Solution C2，涡旋混匀，孵育、离心；转移上清液 到新的收集管中，加入Solution C3，涡旋混匀，孵育，离心；转移上清到新的收集管中，加入Solution C4，涡旋混匀后放入旋转过滤器中，离心弃去滤液，继续加载上清，室温、离心，重复直至过滤完所有上清；加入Solution C5到旋转过滤器中，室温离心，弃去上清后，转移旋转过滤器到收集管中，然后加入Solution C6到白色滤膜中心，离心弃去旋转过滤器；得到总DNA样品，放置-20℃的冰箱中保存，备用；

所述CTAB混合液中CTAB的质量百分比为1.8～2.2％、β-巯基乙醇的浓度为1.8～2.2％(v/v)和PVP的浓度为9～11％(m/v)。

2.如权利要求1所述的提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法，其特征在于，所述野生蔷薇表面消毒操作如下：将野生蔷薇植物组织置于70％酒精中，使植物组织完全浸泡，浸泡时间为1～2min，无菌水清洗数次后；将植物组织再置于4～6％次氯酸钠溶液中，使植物组织完全浸泡，浸泡时间为30～60s，无菌水清洗数次，完成消毒。

3.如权利要求1所述的提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法，其特征在于，所述的CTAB混合液使用前预热至60～70℃。

4.如权利要求1～3任一所述的提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法，其特征在于，所述方法具体操作如下：称取0.15g研磨后的植物组织粉末，置于一个干净无菌研磨中；加入600μL预热至60～65℃的CTAB混合液，充分研磨至粘稠状；再用无菌滤纸收集研磨后的混合物并加入到一个PowerBead Tubes中，轻轻涡旋混匀，加入60μL Solution C1，上下颠倒数次混匀；把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，3200r/m涡旋连续振荡10～15min，室温10000×g离心30～60s；转移上清至一个干净的2mL收集管中，加入250μL Solution C2到上清中，涡旋混匀5～6s，4℃孵育5min，室温10000×g离心1～2min；避开沉淀小珠，转移上清≤600μL到一个新的收集管中，加入200μL Solution C3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min，室温10000×g离心1～2min；避开沉淀小珠，转移上清≤750μL到一个新的收集管中，加入1200μL Solution C4到上清中，涡旋混匀5～6s，加载约675μL上清到旋转过滤器中，室温10000×g离心1min，弃去滤液，继续加载675μL上清，室温10000×g离心1～2min，重复直至过滤完所有上清；加入500μL Solution C5到旋转过滤器中，室温10000×g离心30～60s，弃去上清，室温10000×g离心1～2min；小心转移旋转过滤器到2mL收集管中，加入100μLSolution C6到白色滤膜中心，室温10000×g离心30～60s，弃去旋转过滤器；将总DNA样品放置-20℃的冰箱中保存备用。