[发明专利]一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法

说明书

本发明公开了一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法。所述方法将野生蔷薇表面消毒、液氮研磨处理后，采用CTAB混合液结合土壤微生物DNA强力提取试剂盒提取内生真菌基因组DNA。本发明针对野生蔷薇样品的特殊性进行设计，避免野生蔷薇植物中所含醌类物质、酚类物质、多酚氧化酶及破壁不充分等因素对基因组DNA提取效率的不良影响。此方法可以运用于所有野生蔷薇内生菌基因组的提取，具有应用范围广、提率高的特点。本发明提供的方法应用于野生蔷薇大理紫花内生真菌基因组和野生蔷薇七姐妹内生真菌基因组的提取，都达到良好的提取效果，提取的基因组DNA均可用于各类分子学实验。

技术领域

本发明属于基因组提取技术领域，尤其涉及一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法。

背景技术

蔷薇属野生种是月季遗传资源的主要来源，现代约25000多个月季品种均来自15个蔷薇属原始亲本的不断杂交和回交。由于长期的定向选择和人工栽培，使得现代月季部分抗病基因流失、抗病性较差。目前野生蔷薇资源的优异基因转移到现代月季的栽培品种中，拓宽其遗传基础、培育抗病新品种为抗病育种的主要方向。但由于存在杂交不亲与杂种不育、病原菌生理小种具有高度多样性和变异性，以及大规模引种后，其抗性难以维持等问题，所以通过杂交育种尚不能彻底解决病害防治的问题。

植物内生真菌是真菌的重要组成部分，是指在其生活史的一定或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的真菌，在各类花卉植物中，内生菌的定殖十分普遍。由于长期生活在植物组织内部，与宿主植物协同进化，内生菌与植物之间形成了一种互惠共生关系：植物为内生菌提供生长所需环境和各类营养物质，而内生菌则通过产生种类繁多的生物活性物质来刺激宿主植物的生长发育，提高其对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力，国外已有大量关于利用内生菌增强植物病害防控能力的专利，所以探究内生菌增强宿主植物对各种病原菌的抵抗力具有较大的实践意义。

使用分子生物学方法分析微生物群落结构是目前最重要、最迅速的菌群结构与功能认识的方法之一。在内生菌群落结构研究中，常用的方法是使用特异性引物进行系统发育标记分子的扩增，并通过测定其序列来识别微生物群落的物种组成并定量其丰度。本发明中提取野生蔷薇内生真菌基因组DNA，利用18S rRNA基因扩增、高通量测序的方法，为探明抗病野生蔷薇特有和优势内生真菌抗病功能群，及野生蔷薇抗病的分子机制打下夯实的基础。

野生蔷薇中含有大量多酚、酯类等次生代谢产物、色素、酚基、酚羟基等酚类化合物，致使基因组DNA提取率低、纯度低，对后续分子生物学方面的分析造成阻碍。研究表明，改良CTAB法可提取高质量玫瑰DNA(严廷良等，2014)，但提取高质量的野生蔷薇内生真菌基因组DNA的方法未有研究报道，而且用普通试剂盒及CTAB法提取效果较差，提取到的内生真菌基因组DNA得率少纯度低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法。本发明能够实现高效提取大量野生蔷薇内生真菌基因组的目的，得到的内生真菌基因组DNA纯度高，得率高。

本发明的技术方案如下：一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法，所述方法将野生蔷薇表面消毒、液氮研磨处理后，采用CTAB混合液结合土壤微生物DNA强力提取试剂盒提取内生真菌基因组DNA。

进一步地，所述CTAB混合液中CTAB的质量百分比为1.8～2.2％、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的浓度为9～11％(m/v)。

进一步地，所述土壤微生物DNA强力提取试剂盒为试剂盒。

进一步地，所述野生蔷薇表面消毒操作如下：将野生蔷薇植物组织置于70％酒精中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为1～2min；无菌水清洗数次后；将植物组织再置于4～6％次氯酸钠溶液中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为30～60s；无菌水清洗数次，完成消毒。