[发明专利]能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用

权利要求书

1.能悬浮培养的牛肾细胞MDBK株，具有以下特征：

1）细胞直径：14-25μm；

2）核型：2n=60；

3）可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养；

4）能使用无血清或低血清培养基培养；和

5）复苏后能制成MDBK种细胞悬液用于生物反应器大规模悬浮培养；

所述能悬浮培养的牛肾细胞MDBK，是通过将普通贴壁MDBK细胞经过适应低血清贴壁培养、低血清悬浮培养、无血清悬浮培养过程筛选获得；其中：

所述低血清贴壁培养是指：取长满单层的贴壁MDBK细胞，经V/V为0.25％的胰酶消化分散后加入含V/V为10％的新生牛血清的DMEM培养基与低血清培养基的混合培养基，且混合培养基中低血清培养基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待细胞完全适应混合培养基培养后再增加低血清培养基的含量，最终全部替代为低血清培养基，至细胞生长稳定可连续传代；

所述低血清悬浮培养是指：经低血清贴壁培养驯化好的贴壁MDBK细胞，经V/V为0.25％的胰酶消化分散后加入低血清培养基，稀释细胞至0.5×10⁶细胞/mL，加入三角瓶在37℃恒温摇床100-110rpm培养，富集直至细胞稳定培养；用低血清培养基重悬沉淀细胞并将细胞浓度调节至0.5×10⁶细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养72h至细胞密度达到1.0×10⁶细胞/mL至可稳定传代，得到初步悬浮MDBK细胞；

所述无血清悬浮培养是指：取初步悬浮MDBK细胞，100rpm离心5分钟，弃去上清，加入混合培养基重悬细胞；混合培养基为低血清培养基与无血清CD培养基的混合物，无血清CD培养基含量为30％，连续培养待细胞可稳定培养后增加混合培养基中无血清CD培养基的含量至50％，连续培养待细胞培养稳定后以无血清CD培养基全部替代低血清培养基，至细胞稳定连续传代；

取适应无血清CD培养基培养的悬浮MDBK细胞，将细胞液通过70μm细胞过滤器截留细胞团块，将滤过液100rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜CD培养基重悬细胞，调节细胞密度至0.5×10⁶细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养，重复上述步骤直至细胞结团有所减轻，更换为40μm细胞过滤器，重复上述步骤，经过连续处理细胞结团逐步减轻，得到分散良好细胞为筛选获得的能够悬浮培养的MDBK细胞株；

其中所述低血清培养基为含V/V为3％的新生牛血清的CD培养基。

2.能悬浮培养的牛肾细胞株MDBK-S CGMCC No.11795，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号CGMCC，保藏日期为2015年12月14日。

3.一种牛肾细胞MDBK的悬浮培养方法，是用牛肾细胞专用悬浮培养基将权利要求1或2所述牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×10⁶细胞/mL，然后接种至反应器中，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基，在温度 37℃、溶氧饱和度百分比为40-60％、pH值7.0-7.2、转速 40-60rpm条件下培养48-72小时至反应器内的牛肾细胞MDBK密度达到1.0×10⁶ -4.0×10⁶ 细胞/mL；

所述牛肾细胞专用悬浮培养基为含V/V为1％-5％的新生牛血清的CD培养基或CD培养基。

4.根据权利要求3所述的悬浮培养方法，其特征在于：所述牛肾细胞专用悬浮培养基配方为：含CD培养基粉末15-20 g/L，碳酸氢钠2-3 g/L，pH值7.0-7.2的水溶液。

5.根据权利要求3或4所述的悬浮培养方法，其特征在于：所述牛肾细胞专用悬浮培养基配方为：含CD培养基粉末17.7g/L，使用注射用水溶解后加入碳酸氢钠2.32g/L，调节pH值至7.0-7.2。