[发明专利]能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用

说明书

本发明公开了能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用。本发明牛肾细胞MDBK悬浮培养方法省去了细胞消化、换液、频繁分种等大量人工操作，培养方法简便、快速，而且采用反应器培养实现了工艺自动化，不仅提高了单位体积的细胞产量，还解决了传统贴壁培养细胞批间存在差异的技术难题。本发明的牛肾细胞MDBK及其悬浮培养细胞可用于各类敏感病毒的培养、抗体蛋白生产、疫苗生产、产品外源病毒检验等领域。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别是涉及可悬浮培养的牛肾细胞(MDBK)悬浮培养后在病毒培养及疫苗生产方面的应用。

背景技术

牛肾细胞(MDBK)传代细胞系来自公牛肾细胞，可用于病毒培养、原材料检验、营养代谢研究。MDBK通常可采用克氏瓶、转瓶甚至反应器载体培养，但实质均未改变，细胞均为贴壁培养工艺，贴壁培养工艺培养批量较小、批间差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多，细胞单位产量低，大规模生产工艺复杂。

牛病毒性腹泻/粘膜、牛传染性鼻气管炎、伪狂犬等病毒培养或疫苗生产通常采用MDBK贴壁细胞静置培养或转瓶培养的方法进行扩增，但存在贴壁培养工艺放大繁琐、培养批量较小、批间差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多等诸多问题，细胞单位产量低，大规模生产工艺复杂。CN104162154A中提出利用悬浮培养技术生产牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其使用经过驯化的MDBK细胞并未形成能够稳定传代的悬浮细胞株，由于细胞悬浮驯化存在不确定因素，并不是每次都能成功复制，在生产应用中存在较大困难。

发明内容

本发明的一个目的是提供可以悬浮培养的牛肾细胞。

本发明确定的能悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：1)细胞直径：14-25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养；4)使用无血清或低血清培养基培养；或/和5)可使用生物反应器大规模培养。

具体的，能悬浮培养的牛肾细胞MDBK为能悬浮培养的牛肾细胞株MDBK-S CGMCCNo.11795。

本发明另一目的在于提供所述能悬浮培养的牛肾细胞MDBK的筛选方法，是将普通贴壁MDBK细胞经过适应低血清贴壁培养、低血清悬浮培养、无血清悬浮培养等过程，筛选获得能够悬浮培养的MDBK细胞株。

该筛选方法中，所述低血清贴壁培养是指：取长满单层的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入含10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养基与低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)的混合培养基，且混合培养基中低血清培养基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待细胞完全适应混合培养基培 养后再增加低血清培养基的含量，最终全部替代为低血清培养基，至细胞生长稳定可连续传代；

所述低血清悬浮培养是指：经低血清贴壁培养驯化好的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)，稀释细胞至0.5×10⁶细胞/mL，加入三角瓶在37℃恒温摇床100-110rpm培养，富集直至细胞稳定培养；用低血清培养基重悬沉淀细胞并将细胞浓度调节至0.5×10⁶细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养72h至细胞密度达到1.0×10⁶细胞/mL至可稳定传代，得到初步悬浮MDBK细胞；