[发明专利]一种检测ST‑II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含以下组分：

（1）反应液I（23μL）：10×Thermopol buffer 2.5μL；2.5mM dNTP mix 1～6μL；25mM MgCl2 0～3μL；8U/uL Bst DNA 酶 0.2～1.2μL；10μM正向外引物F3 0.2～0.7μL；10μM反向外引物B3 0.2～0.7μL；10μM正向内引物FIP 2～5μL；10μM反向内引物BIP 2～5μL、其余为灭菌超纯水；

所述正向外引物F3序列为：5’- GCAATAAGGTTGAGGTGATT -3’；

所述反向外引物B3序列为：5’- GCAACCATTATTTGGGCG -3’；

所述正向内引物FIP序列为：5’- TGATTGTGTAGATGCATAGGCATTATTTCTTCTTGCATCTATGTTCG -3；

所述反向内引物BIP序列为：5’- TAGACAAATAGCCAAGGAAAGTTGTTGCTCCAGCAGTACCATC -3

（2）阳性DNA（2μL）：待测样品DNA；

（3）显色液（1μL）：SYBR Green I。

2.根据权利要求1所述的一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液I（23μL）组成为：10×Thermopol buffer 2.5μL；10mM的dNTPs 4μL；25mM的MgCl2 1μL；8μL/μL的Bst DNA 酶 0.6μL；10μM的正向外引物F3 0.5μL；10μM的反向外引物B3 0.5μL；10μM的正向内引物FIP 2μL；10μM的反向内引物BIP 2μL，灭菌超纯水9.9μL。

3.根据权利要求1所述的一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述10×Thermopol buffer含有200mM pH 值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、100mM氯化钾（KCl）、100mM硫酸铵（（NH₄）₂SO₄）、20mM硫酸镁（MgSO₄）及1％曲拉通X-100（Triton-100）。

4.根据权利要求1所述的一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述显色液SYBR Green I为1000×SYBR Green I。

5.如权利要求1所述的一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）DNA的提取：采用煮沸法提取DNA，取1mL细菌培养物，12000r/min离心5min；加入100μL超纯水，混匀，100℃煮沸，迅速转移至-20℃冷冻5min，然后4℃ 12000r/min离心5min，取上清，即为待测样品中的DNA；

（b）LAMP扩增： 配置23μL反应液，取2μL 待测样品DNA与反应液混匀，组成25μL反应体系；取1μL SYBR Green滴加在反应管盖内侧，小心操作以免染料掉入反应体系内；将反应管置于60℃～63℃的恒温水浴45min，进行LAMP扩增，85℃加热 5min灭活酶的活性；

（c）取出反应管进行结果判断：倒置反应管，混匀显色液和反应液，若颜色为绿色，则样品中含有ST-II型产肠毒素大肠杆菌，若颜色为橘黄色，则样品中不含有ST-II型产肠毒素大肠杆菌。