[发明专利]一种检测ST‑II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速检测产肠毒素大肠杆菌ST-II毒素的LAMP检测试剂盒。

背景技术

大肠杆菌为肠道中最常见的一类细菌。依据它的致病性大致可分为 ：肠致病性大肠杆菌 （Enteropathogenic E.coli，EPEC），侵袭性大肠杆菌 （Enteroinvasive E.coli，EIEC）、 产毒素性大肠杆菌 （Enterotoxigenic E.coli，ETEC）、肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC/STEC） 及粘附性大肠埃希菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）。 其中ETEC可产生不耐热性肠毒素 （heat labile enterotoxin，LT） 和耐热性肠素 （heat stable enterotoxin，ST）， 从而导致人或是牲畜出现严重的腹泻。

目前对产肠毒素大肠杆菌的检测方法有传统的检测方法和基因检测方法。

传统的检测方法主要依赖于生理生化鉴定和毒素试验，生理生化试验参照GB4789.3进行，毒素试验是判断大肠杆菌致病性的重要指标。在检测毒素时，常用的方法是家兔结扎回肠试验、乳鼠灌胃试验和双向琼脂扩散试验，然而这些传统的检测方法费时费力，操作复杂，已不能满足基层和临床中及时、灵敏、快速的检测要求，不利于疾病的预防。

基因检测技术主要是聚合酶链式反应（PCR），PCR技术是一种利用DNA聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定，变异检测等分子生物学研究。PCR检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原检测的重要技术之一，主要包括常规PCR、巢式PCR、和实时荧光定量PCR等，但该技术需要依靠昂贵的PCR仪器设备，不利于基层生产上推广应用。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术是由日本科学家开发的一种新颖的简便、快速、高效及廉价的核酸体外扩增技术。该技术针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在等温条件下，通过Bst DNA聚合酶的链置换作用，短时间内便使得产物得到大量扩增，扩增产物加入荧光染料SYBR Green I后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可通过肉眼直接观察。与常规PCR相比，该技术不需要模板的热变性，温度循环、电泳及紫外观察等过程，反应速度更快。因其具有特异性强、灵敏度高、设备简单、扩增效率高以及产物检测简便等特点，尤为适合基层和现场病原检测工作的需求。近年来，关于LAMP技术的研究已经取得了较大的进展，已经在细菌检测、病毒检测、寄生虫检测、真菌和支原体检测、动物胚胎性别鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测中广泛应用。

本发明采用环介导等温扩增技术，建立了快速检测ST-II型产肠毒素大肠杆菌的方法，提高了检测效率以及灵敏性，为基层准确检测产肠毒素大肠杆菌提供了可能。

发明内容

本发明提供了一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，目的是实现对产肠毒素大肠杆菌进行特异、快速、简便的现场检测，改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。

本发明所采用的技术方案是：

1.LAMP引物的设计

从GenBank检索获得产肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素ST-II基因序列，通过MegAlign软件进行同源性对比分析，获得一段ST-II毒素基因的保守序列SEQ NO.1，采用Primer Explorer V4软件设计了4条特异性LAMP检测引物，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP，引物序列分别为：

正向外引物F3：5’- GCAATAAGGTTGAGGTGATT -3’；

反向外引物B3：5’- GCAACCATTATTTGGGCG -3’；

正向内引物FIP：5’- TGATTGTGTAGATGCATAGGCATTATTTCTTCTTGCATCTATGTTCG -3；

反向内内引物BIP：5’- TAGACAAATAGCCAAGGAAAGTTGTTGCTCCAGCAGTACCATC -3；

2.根据所得LAMP引物配制LAMP反应液，构成检测体系，进而组装成一种用于检测产肠毒素大肠杆菌肠毒素ST-II的LAMP试剂盒。

本发明的一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其包含如下组分：