[发明专利]一种基于高内涵技术定量分析苯或苯的代谢物致细胞DNA损伤的方法

权利要求书

1.一种基于高内涵技术定量分析苯或苯的代谢物致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：

1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；

2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含苯或苯的代谢物和细胞培养液；

3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；

4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述细胞为贴壁生长细胞；

优选地，接种时，所述细胞处于对数生长期，以单细胞悬液接种于细胞培养液中；

更优选地，细胞接种后将细胞在细胞培养液中于37℃，5％CO₂条件下培养24h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，苯的代谢物优选为氢醌类化合物，更优选为对苯二酚；

优选地，所述细胞染毒液中苯的浓度为0-500μg/mL，优选>0且≤500μg/mL，更优选为2.44-500μg/mL，进一步优选2.44-50μg/mL；或者

优选地，所述细胞染毒液中苯的代谢物的浓度为0-8.08μg/mL，优选>0且≤8.08μg/mL，更优选为0.13-8.08μg/mL；

优选地，在所述细胞染毒液中培养细胞1-24h、优选24h。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)包括：

3-1)吸弃所述细胞染毒液，洗涤细胞，加入多聚甲醛进行细胞固定；

3-2)洗涤细胞，然后加入Triton-100X以使细胞通透；

3-3)洗涤细胞，然后加入血清白蛋白封闭，之后加入一抗即抗γH2AX抗体进行孵育；

3-4)洗涤细胞，然后加入免疫荧光标记的二抗进行孵育；

3-5)洗涤细胞，加入DAPI进行染色；

3-6)洗涤细胞，保存。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定分别在两组不同的激发波长和发射波长下进行；

优选地，所述步骤3-4)中，免疫荧光标记的二抗为Alexa Fluor 488标记的二抗，并且所述步骤4)中，在通道一中以激发波长358nm和发射波长461nm进行细胞核的荧光测定，在通道二中以激发波长495nm和发射波长519nm进行γH2AX的荧光测定，以获得通道一所识别的有效细胞的有效细胞核内通道二所检测的平均荧光强度，由此表征γH2AX的含量；

优选地，在两个通道中，测量倍数为200倍，每孔分析和测定9个视野。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，任选地，所述方法还包括，设置在步骤3-3)中没有加入一抗、仅在步骤3-4)中加入二抗的空白对照组，从而在步骤4)中得到由非特异吸附引起的空白信号，由此从检测到的荧光测定信号中扣除空白信号。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，通过在步骤2)中设置多种包含不同浓度的苯或苯的代谢物的细胞染毒液，进行所述方法，最后根据步骤4)获得的γH2AX平均荧光强度和苯或苯的代谢物的浓度绘制剂量-效应曲线。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，通过在步骤2)中将细胞在包含相同浓度的苯或苯的代谢物的细胞染毒液中培养不同时间，进行所述方法，最后根据步骤4)获得的γH2AX平均荧光强度和培养时间绘制时间-效应曲线。