[发明专利]一种基于高内涵技术定量分析苯或苯的代谢物致细胞DNA损伤的方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA损伤体外检测技术领域，更具体而言，本发明涉及苯或苯的代谢物致细胞DNA损伤的体外定量分析方法。

背景技术

苯是一种常见的空气污染物，可以诱发骨髓细胞染色体畸变、染色体断裂等。动物实验表明经过各种途径的苯的暴露可以引起多种类型的肿瘤。同时，职业暴露人群的流行病学指出苯暴露可能和急性或慢性骨髓白血病相关。目前世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究组织(IARC)已经将苯列为1类致癌物，同时世界卫生组织烟草控制框架公约(FCTC)将苯列为烟气优先级管制污染物之一。苯及其代谢物可以与DNA形成加合物，致使抑瘤基因p53和致癌基因发生突变。此外，苯及其代谢物可以诱导细胞产生活性氧，与DNA形成加合物，诱导DNA链的断裂，并产生微核，姐妹染色单体交换等染色体畸变。因此，准确检测苯及其代谢物对细胞DNA的损伤对于苯及其代谢物的遗传毒性和危害性评价具有重要的意义。

DNA双链断裂是DNA最严重的一种损伤形式，如果这种损伤不能被正确或者及时修复就可能会导致染色体畸变或者细胞凋亡等。作为DNA双链断裂的一种生物标志物，磷酸化组蛋白γH2AX已经被广泛地应用于临床医药学、放射学及毒理学等研究方面。包括很多单体化合物和混合物通过γH2AX实验对其遗传毒性进行了测定和评价。例如，Tanaka等利用γH2AX实验对卷烟烟气冷凝物的遗传毒性进行了检测和评价；Smart等采用γH2AX实验对依托泊苷、米托蒽醌及甲基亚硝脲的DNA双链断裂的剂量-效应关系进行了研究。该实验因其灵敏性高、结合其他仪器检测技术可以进行大规模分析检测，拥有其他遗传毒性检测技术并不具备的多种优点，目前已经被广泛地应用于化合物和有毒物质的遗传毒性筛选和评价。

目前对γH2AX进行分析检测的主要方法有流式细胞仪、ELISA(酶联免疫吸附试验)、Western Blot(蛋白质印迹)、显微镜技术等。流式细胞仪和Western Blot操作繁琐，检测前需要将贴壁细胞酶解成单细胞悬液，破坏了细胞的结构和功能完整性，且检测通量较低。ELISA不能提供细胞内荧光焦点的分布情况且需要额外添加其他检测蛋白对结果进行校正，而显微镜技术的检测通量低，且人为计数的误差较大。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种无需破坏细胞、简单、有效且灵敏度高的苯或苯的代谢物致DNA损伤的定量分析方法，该方法的检测结果准确并且可视化，以克服现有技术的缺陷。

本发明的目的通过将高内涵技术和γH2AX的定量分析相结合而实现。具体而言，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于高内涵技术定量分析苯或苯的代谢物致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：

1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；

2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含苯或苯的代谢物和细胞培养液；

3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；

4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。

优选地，所述步骤1)中，所述细胞为贴壁生长细胞；更优选地，接种时，所述细胞处于对数生长期，以单细胞悬液接种于细胞培养液中；

更优选地，细胞接种后将细胞在细胞培养液中于37℃，5％CO₂条件下培养24h。

优选地，所述步骤2)中，苯的代谢物是指氢醌类化合物，其在体内代谢产生；优选地，所述苯的代谢物为对苯二酚；

更优选地，所述细胞染毒液中苯的浓度为0-500μg/mL，优选>0且≤500μg/mL，更优选为2.44-500μg/mL，进一步优选2.44-50μg/mL；或者，所述细胞染毒液中苯的代谢物的浓度为0-8.08μg/mL，优选>0且≤8.08μg/mL，更优选为0.13-8.08μg/mL；

根据本发明的具体实施方式，所述细胞染毒液中苯的浓度可以是0、2.44、4.89、9.77、19.54、39.08、78.16、156.25、312.5或500μg/mL，或者所述细胞染毒液中苯的代谢物的浓度可以是0.13、0.25、0.51、1.01、2.02、4.04、6.06或8.08μg/mL。

优选地，在所述细胞染毒液中培养细胞1-24h、优选24h。

优选地，所述步骤3)包括：