[发明专利]一种弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗及规模化制备技术

权利要求书

1.一种哈氏弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗，所述疫苗包括以下组分：哈氏弧菌外膜蛋白Ompk和Montanide ISA 763A佐剂。

2.根据权利要求1所述的哈氏弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗，其特征在于：所述哈氏弧菌外膜蛋白Ompk与Montanide ISA 763A佐剂的比例为2:3。

3.根据权利要求2所述的哈氏弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗，其特征在于：所述哈氏弧菌外膜蛋白Ompk的浓度高于1.5mg/mL。

4.一种制备权利要求1-3任一所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，该技术包括如下步骤：将哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液和Montanide ISA 763A佐剂，按2:3比例混合搅拌均匀，乳化，无菌灌装，即得到疫苗成品。

5.根据权利要求4所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，其特征在于，所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术包括如下步骤：

将20L哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液，加入4L pH7.0的无菌磷酸缓冲液，过滤除菌后加入油相罐，将灭菌后的Montanide ISA 763A佐剂36L，缓慢加入，搅拌速度50-100r/min。在搅拌混合30min后，乳化30min，在无菌条件下，灌装制得疫苗成品。

6.根据权利要求5所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，其特征在于：所述将哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液的制备包括如下步骤：

(1)工程菌一级种子制备

(2)工程菌二级种子制备

(3)高密度培养诱导外膜蛋白表达与工程菌体获取

(4)外膜蛋白的提取与浓缩。

7.根据权利要求6所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，其特征在于，所述工程菌一级种子制备包括如下步骤：工程菌接种营养琼脂，30℃条件下培养24小时，挑菌苔接种300ml营养肉汤，在30℃，180r/min条件下，培养10小时，得到一级种子液。

8.根据权利要求7所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，其特征在于，所述工程菌二级种子制备包括如下步骤：一级种子液,接种30L发酵培养基，在30℃条件下通气搅拌培养10h，得到二级种子。

9.根据权利要求8所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，其特征在于，所述高密度培养诱导外膜蛋白表达与工程菌体的获取包括如下步骤：二级种子接种300L发酵培养基，30℃，200r/min，通气量250L/min培养，培养4小时后补料，6小时开始升温42℃诱导表达，每隔1h，取样，测定菌液A600值，直到菌液A600开始下降，停止发酵；测定工程菌体生物量和目标蛋白表达情况；培养得到的工程菌液利用管式离心机离心(13500r/min)收集菌体,称重、-20℃冻融12h以上。

10.根据权利要求9所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，其特征在于，所述外膜蛋白的提取与浓缩包括如下步骤：外膜蛋白的提取与浓缩工程菌体融解、配制悬浮液，超声波破碎4个循环；离心收集包涵体；用100L洗涤液洗涤1次，离心收集沉淀；加入包涵体溶解液，在28℃条件下，裂解2h以上，随后离心收集上清液；切向流超滤收集浓缩液；脱盐、蛋白质复性；测定蛋白质浓度和外膜蛋白的纯度，-20℃保存。