[发明专利]一种弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗及规模化制备技术

说明书

技术领域

本发明属水产养殖病害免疫防治技术领域，具体涉及一种海水鱼弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗及规模化化制备技术。

背景技术

病原性弧菌是海水养殖动物最重要的细菌性病原，其引起的病害通常被称为“弧菌病”。哈氏弧菌是海水鱼养殖细菌性疾病的重要病原之一。研究人员在研制各类灭活疫苗的同时，也对外膜蛋白亚单位疫苗进行研发以对海水鱼养殖病害进行免疫防治。由于我国水产疫苗研制起步较晚，一些水产领域用于疫病防治的亚单位疫苗基本还处于实验室规模，目前尚未有亚单位疫苗可规模化生产与应用于海水鱼的疾病免疫防治。

发明内容

为了解决现有技术中的诸多问题，本发明提供了一种弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗及规模化制备技术。

本发明通过如下的技术方案来实现：

一种哈氏弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗，所述疫苗包括以下组分：哈氏弧菌外膜蛋白Ompk和Montanide ISA 763A佐剂。

优选的，所述哈氏弧菌外膜蛋白Ompk与Montanide ISA 763A佐剂的比例为2:3。

优选的，所述哈氏弧菌外膜蛋白Ompk的浓度高于1.5mg/mL。

本发明还提供了一种哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，该技术包括如下步骤：将哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液和Montanide ISA 763A 佐剂，按2:3比例混合搅拌均匀，乳化，无菌灌装，即得到疫苗成品。

优选的，所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术包括如下步骤：

将20L哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液，加入4L pH7.0的无菌磷酸缓冲液，过滤除菌后加入油相罐，将灭菌后的Montanide ISA 763A佐剂36L，缓慢加入，搅拌速度50-100r/min。在搅拌混合30min后，乳化30min，在无菌条件下，灌装制得疫苗成品。

优选的，所述所述的哈氏弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗规模化制备技术，其特征在于，所述将哈氏弧菌外膜蛋白Ompk溶液的制备包括如下步骤：

(1)工程菌一级种子制备

(2)工程菌二级种子制备

(3)高密度培养诱导外膜蛋白表达与工程菌体获取

(4)外膜蛋白的提取与浓缩。

优选的，所述工程菌一级种子制备包括如下步骤：工程菌接种营养琼脂，30℃条件下培养24小时，挑菌苔接种300ml营养肉汤，在30℃，180r/min条件下，培养10小时，得到一级种子液。

优选的，所述工程菌二级种子制备包括如下步骤：一级种子液,接种30L发酵培养基，在30℃条件下通气搅拌培养10h，得到二级种子。

优选的，所述高密度培养诱导外膜蛋白表达与工程菌体获取，包括如下步骤：二级种子接种300L发酵培养基，30℃，200r/min，通气量250L/min培养，培养4小时后补料，6小时开始升温42℃诱导表达，每隔1h，取样，测定菌液A600值，直到菌液A600开始下降，停止发酵；测定工程菌体生物量和目标蛋白表达情况；培养得到的工程菌液利用管式离心机离心(13500r/min)收集菌体,称重、-20℃冻融12h以上。

优选的，所述外膜蛋白的提取与浓缩包括如下步骤：外膜蛋白的提取与浓缩工程菌体融解、配制悬浮液，超声波破碎4个循环；离心收集包涵体；用100L洗涤液洗涤1次，离心收集沉淀；加入包涵体溶解液，在28℃条件下，裂解2h以上，随后离心收集上清液；切向流超滤收集浓缩液；脱盐、蛋白质复性；测定蛋白质浓度和外膜蛋白的纯度，-20℃保存。

本发明提供的海水鱼弧菌病免疫防治的弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗规模化生产技术，其中哈维氏弧菌外膜蛋白Ompk，是以哈维氏弧菌EcGS020802基因组DNA为模板，克隆得到，并在大肠杆菌重组表达，得到工程菌，通过对工程菌逐级放大培养，在500L发酵罐进行高密度培养与诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体离心得到包涵体，经清洗包涵体，再裂解包涵体，离心得到裂解液，浓缩达一定体积后，进行多轮次脱盐、蛋白复性，最终得到外膜蛋白液，与Montanide ISA 763A佐剂按照一定比例乳化制得外膜蛋白亚单位佐剂疫苗成品。本发明中的海水鱼弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗工厂化制备技术，可规模化生产，降低疫苗制备成本。疫苗可通过注射方式施用，免疫养殖海水鱼类，免疫效果良好，可有效预防弧菌引起的弧菌病，减少病害损失。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。