[发明专利]用于构建测序文库的接头核酸分子

说明书

本发明提出了一种用于构建测序文库的接头核酸分子。该核酸分子包括第一核酸链，所述第一核酸链包含PCR反应断点，所述PCR反应断点包括选自下列的至少之一：(1)核酸消化酶特异性识别位点；以及(2)DNA聚合酶不识别位点。本申请所述的接头核酸分子可以应用于低起始量样品的建库，适应更宽的mRNA含量的变化。利用本申请所述的接头核酸分子进行构建测序文库，能够有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。

技术领域

本发明涉及生物测序领域，具体地，本发明涉及用于构建测序文库的接头核酸分子，更具体地，本发明涉及构建测序文库的接头核酸分子、构建测序文库的方法、测序文库、核酸样本测序方法、构建测序文库的设备以及用于对核酸样本进行测序的系统。

背景技术

Illumina公司的Truseq RNA librarykit做RNA测序具有很好灵敏度，能适应很多物种的RNA建库，但是由于不同物种、生理、发育、组织、分化等条件下，其总RNA的mRNA含量会不一样，实践中当遇到某些样品的mRNA含量很低时，此kit的建库产物就会出现一些奇怪的产物。现阶段的RNA检测技术又难以特异性地对mRNA含量进行定量，特别是对于总RNA量本来就很少的样品来说，还面临检测灵敏度不够的问题。

因此，如何提高建库产物的质量以及如何提高测序的灵敏度是科学工作者拭待解决的关键问题。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的。

为调查尖峰形成原因，发明人在实验中模拟不同的mRNA含量，分别用200ng、20ng的UHRR(RNA标准品)起始mRNA量进行建库。发明人发现，20ng文库经Hiseq平台上测序后，文库测序碱基波动很大，测序质量很差。后经对文库测序的reads序列进行分析发现，这些“锯齿”状的尖峰实则为DNA接头的互连、自连接产物，而因接头互连、自连个数、组合方式的不同，而形成长短不一的产物，Agilent2100检测后就呈“ladder”状显现。已知接头长度约62nt，而实测这些“ladder”状的尖峰的长度间距也接近62nt。这些尖锋是建库所使用的DNA接头的不同个数、不同组合的连续互连、自连的产物。

但在测序中，有明显“ladder”峰的通常视为不合格，如果冒险尝试上机，则碱基波动很大，测序质量不好，接头序列(被视为empty-reads)数据占比高达30％以上。如果“ladder”峰的大小不明显而隐藏在文库里面，也会使测序时的碱基波动很大，严重影响测序质量，增加数据中的接头序列比例，影响有效数据的产出(empty-reads占比)。因此，文库中的接头互连、自连产物严重影响了测序质量，发明人需要进一步有效消除此成分，以此来提高测序质量。

而现有的消除接头互连、自连产物的方法包括(1)利用DNA片段长短的差别，通过电泳切胶分离法，去除引物二聚体，进而选择在一定长度范围的目的片段；(2)利用DNA片段长短的差别，通过磁珠的吸附，筛选去除二聚体、选择在一定长度范围的目的片段。但现有的方法(1)切胶操作低效，所需时间长，如电泳要2小时，切胶及产物回收需30分钟；(2)DNA接头互连、自连的产物，会因接头连接个数、组合不同而长度不一，大小相差约为62nt，产物长度会与目的文库的片段长度重叠，掺杂在一起，难以用片段长度差异筛选的原理进行分选。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的发明人通过巧妙地设计接头序列，利用核酸消化酶特异性识别碱基位点的原理或DNA聚合酶不识别特异性碱基位点的原理，实现有效清除文库中的接头互连、自连产物，从而降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。该清除步骤过程相比于现有技术，更加快速、简单，不需要切胶，不产生EB污染，并且能够有效消除了文库Agilent2100质检的互连、自连产物存在的导致数据质量差的隐患。