[发明专利]一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法

权利要求书

1.一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）植物总RNA的提取及引物设计：提取感病甜樱桃叶片总RNA， -80℃保存备用；

（2）HSVd全长cDNA克隆及测序：以提取的总RNA为模板，反转录试剂盒中的随机引物进行RT-PCR反转录，反应体系为20μL；以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应，R1和F1为引物；

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为） 回收目的片段，将回收的片段与pGEM-T（Promega）载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性质粒；

（3）HSVd侵染性克隆的构建：将所得分离物序列与HSVd序列进行比较，对测序正确的菌株摇菌提取质粒；以提取的质粒为模板，以4个HSVd全长片段的HSVd-F1/HSVd-R1和HSVd-F2/HSVd-R2为引物，引物对HSVd-F1/HSVd-R1用于扩增第一个片段，引物对HSVd-F2/HSVd-R2用于扩增第二个片段，利用高保真酶分别进行PCR扩增获得HSVd全长片段，电泳后切胶回收；将两个片段与载体进行重组反应，反应结束后瞬时离心，将离心管置于冰上冷却5min；重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性质粒；

（4）质粒接种及抗病性鉴定：将获得含有HSVd cDNA加倍串联序列的克隆质粒pGEM-HSVd-HSVd，提取质粒pGEM-HSVd-HSVd，通过茎杆注射方法进行接种甜樱桃砧木G6，同时以接种空白质粒pGEM的植株为阴性对照。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述引物对序列R1和F1如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述反转录的反应体系中含有总RNA 2μg，2×TS Reation Mix 10 μL，随机引物2 pmol，TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH₂O至20 μL，混匀；42℃孵育30 min，冰上冷却2 min，-20℃保存备用。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增反应的体系为50μL，含有5×TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5 mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，引物对R1和F1各1μL (10μM), 模板2μL，加ddH₂O至50μL, 混匀；PCR扩增反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一个片段的上游引物HSVd-F1如SEQ ID NO:3所示；，所述下游引物HSVd-R1如SEQ ID NO:4所示；所述第二个片段的上游引物HSVd-F2如SEQ ID NO:5所示；所述下游引物HSVd-R2如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求1或5的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述重组反应的体系为，pGEM-T线性化载体0.25 pmol，两个插入片段（总量）0.5 pmol，2×EasyGeno Assembly Mix 5μL，加ddH₂O补足至10μL；将混合反应液置于50℃反应15 min。