[发明专利]一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法。

背景技术

啤酒花矮化类病毒 (Hop stunt viroid，HSVd)属于马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)，是啤酒花矮化类病毒属 (Hostnviroid)的唯一成员。其寄主范围非常广泛，包括啤酒花、黄瓜、葡萄、柑橘、梨、桃、李、杏和扁桃等。其中葡萄和杏在感染HSVd后不表现症状，而啤酒花、桃、李和柑橘被感染后则会引发严重的病害，如啤酒花矮化、李和桃斑果病、柑橘矮化和裂皮病等。

类病毒内及类病毒间的重组现已被认为对类病毒的起源进化具有重要意义且与类病毒致病性密切有关，而类病毒侵染性克隆技术是研究类病毒与寄主互作分子机制的有效手段。构建类病毒侵染性克隆已成为国际上开展类病毒生物学活性、序列变异、致病机理等相关研究的重要实验手段，因此构建啤酒花矮化类病毒侵染性克隆，将对深入研究该类病毒序列与功能之间的关系具有重要意义。现有技术中，针对甜樱桃啤酒花矮化类病毒克隆的构建等方面还未曾有报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法。

本发明所采用的具体的技术方案为：

本发明提供了一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法，包括以下步骤：

（1）植物总RNA的提取及引物设计：提取感病甜樱桃叶片总RNA， -80℃保存备用；

（2）HSVd全长cDNA克隆及测序：以提取的总RNA为模板，反转录试剂盒中的随机引物进行RT-PCR反转录，反应体系为20μL；以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应，R1和F1为引物；

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为） 回收目的片段，将回收的片段与pGEM-T（Promega）载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性质粒；

（3）HSVd侵染性克隆的构建：将所得分离物序列与HSVd序列进行比较，对测序正确的菌株摇菌提取质粒；以提取的质粒为模板，以4个HSVd全长片段的HSVd-F1/HSVd-R1和HSVd-F2/HSVd-R2为引物，引物对HSVd-F1/HSVd-R1用于扩增第一个片段，引物对HSVd-F2/HSVd-R2用于扩增第二个片段，利用高保真酶分别进行PCR扩增获得HSVd全长片段，电泳后切胶回收；将两个片段与载体进行重组反应，反应结束后瞬时离心，将离心管置于冰上冷却5min；重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性质粒；

（4）质粒接种及抗病性鉴定：将获得含有HSVd cDNA加倍串联序列的克隆质粒pGEM-HSVd-HSVd，提取质粒pGEM-HSVd-HSVd，通过茎杆注射方法进行接种甜樱桃砧木G6，同时以接种空白质粒pGEM的植株为阴性对照。

进一步的，步骤（2）中，所述引物对序列R1和F1如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

R1（5′-TTGTTCTATCTGCGCCTCTGCC-3′）和F1(5′-AAGCAGGTTGGAGCGAACCGA-3′)

进一步的，步骤（2）中，所述反转录的反应体系中含有总RNA 2μg，2×TS Reation Mix 10 μL，随机引物2 pmol，TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH₂O至20 μL，混匀；42℃孵育30 min，冰上冷却2 min，-20℃保存备用。

进一步的，步骤（2）中，所述PCR扩增反应的体系为50μL，含有5×TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5 mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，引物对R1和F1各1μL (10μM)，模板2μL，加ddH₂O至50μL, 混匀；PCR扩增反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。