[发明专利]一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，包括下述步骤：

将纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体依次进行下述处理：

1)含有4M尿素缓冲液透析12-24小时；

所述的含有4M尿素缓冲液的配方为：20mM Tris,100mM NaCl,5％Glycerol,1％Glycine,5mM EDTA,0.1mM GSSG,1mM GSH,4M Urea，pH 8.5；

2)含有2M尿素缓冲液透析12-24小时；

所述的含有2M尿素缓冲液的配方为：20mM Tris,100mM NaCl,5％Glycerol,1％Glycine,5mM EDTA,0.1mM GSSG,1mM GSH,2M Urea，PH 8.5；

3)含有1M尿素缓冲液透析12-24小时；

所述的含有1M尿素缓冲液的配方为：20mM Tris,100mM NaCl,5％Glycerol,1％Glycine,5mM EDTA,0.1mM GSSG,1mM GSH,1M Urea，PH 8.5；

4)不含尿素缓冲液透析10-24小时，并继续透析2-3遍，即得具备活性的霍乱毒素B亚基蛋白；所述的不含尿素缓冲液的配方为：20mM Tris,100mM NaCl,PH8.5；

以上透析过程中所用透析袋的规格为10KD；所述的纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体的浓度为0.2mg/mL；

所述的纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体的制备方法包括：

1).原核表达载体的构建：将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列克隆到pET28a-OH载体上，得到CTB-pET28a-OH表达载体；pET28a-OH载体是通过PCR删掉pET-28a(+)的N端His-Tag以后至BamH I以前的序列得到；

2).表达载体转化：将CTB-pET28a-OH表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中；

3).单克隆活化：挑取含有CTB-pET28a-OH表达载体的单克隆，在5ml含有卡纳抗性的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养进行活化；

4).放大培养：将活化12小时的菌液转入1L含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm继续振荡放大培养；

5).诱导表达：放大培养4小时，菌液OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为1.0mM的IPTG，37℃，220rpm继续振荡培养6小时；

6).细菌收集：6000rpm，离心10min，收集细菌；

7).超声波破碎细菌：收集的细菌用50mL裂解缓冲液悬浮，冰水中超声破碎细菌；

8).包涵体收集：超声后破碎的细菌，12000g，离心20min，去掉上清，留包涵体；

9).包涵体清洗：包涵体用50mL清洗缓冲液悬浮，并使用研磨器充分研磨包涵体10min混匀，然后12000g，离心20min，去上清，得包涵体，包涵体再按照本步骤重复清洗3遍；所述的清洗缓冲液的配方为：50mM Tris,500mM NaCl,10mMβ-巯基乙醇，2M Urea,PH 8.5；

10).包涵体溶解：清洗后的包涵体用100mL溶解缓冲液溶解，并在4℃，200rpm持续搅拌20小时，使包涵体充分溶解；所述的溶解缓冲液的配方为：50mM Tris,500mM NaCl,10mMβ-巯基乙醇,6M盐酸胍,PH 8.5；

11).包涵体的亲和纯化：使用镍柱亲和纯化，结合缓冲液的配方为：50mM Tris,500mMNaCl,20mM咪唑,8M Urea,PH 8.5,平衡10个柱长；盐酸胍溶解的包涵体离心，20000rpm，30min，上清与镍柱亲和，流速为2ml/min，再使用洗脱缓冲液将蛋白洗脱下来，洗脱速度是2ml/min，既得纯度≥95％以上的CTB包涵体；

所述的洗脱缓冲液的配方为：50mM Tris,500mM NaCl,250mM咪唑,8M Urea,PH 8.5。

2.根据权利要求1所述的方法，所述纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体依次进行下述处理：

1)含有4M尿素缓冲液透析24小时；

2)含有2M尿素缓冲液透析24小时；

3)含有1M尿素缓冲液透析24小时；

4)不含尿素缓冲液透析24小时；

5)不含尿素缓冲液透析10小时；

6)不含尿素缓冲液透析10小时，即得具备活性的霍乱毒素B亚基蛋白。