[发明专利]一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，通过利用原核表达载体，在大肠杆菌中大量表达霍乱毒素亚基，然后在体外进行高效复性，得到大量具有生物活性的霍乱毒素B亚基，普通实验室均可操作，无污染。最重要的优点是，可以根据实验需求，进行各种荧光，同位素，示踪剂标记。

技术领域

本发明涉及生物技术和资源利用与可持续发展领域，具体涉及一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法。

背景技术

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起一种烈性肠道传染病，表现为腹泻脱水、休克甚至死亡，属于国际检疫传染病。世界卫生组织2016年统计数据显示，全球每年爆发130～400万起霍乱病例，每年因为霍乱造成2.1～14.3万人死亡。霍乱严重危害人类健康，而霍乱毒素(Cholera toxin，CT)是霍乱弧菌分泌的一种具有ADP-核糖基转移酶活性的毒素，是引起腹泻的主要因素。CT是一种典型的AB5结构的毒素，5个B亚基非共价结合成非常紧凑稳定的圆桶状五聚体；A亚基(CTA)呈球形，由CTA1和CTA2两部分组成，CTA1与CTA2由肽键和二硫键相连，CTA2肽插入CTB五聚体的桶状中心，并与B5非共价紧密结合，形成支架将A1与B5连在一起。CT通过CTB与肠道上皮细胞膜GM1受体(单唾液酸神经节苷脂)结合后，内吞经脂质筏运输到达高尔基体(Orlandi and Fishman,1998；Wolf et al.,1998)，再到内质网。在内质网中，霍乱毒素与内质网腔中的一些宿主蛋白相互作用，使A亚基的A1部分和毒素其它部分分离，并且被去折叠，形成无结构的多肽链，进入细胞质基质，重新形成有结构的具有酶活性的蛋白(Tsai et al.,2001；Tsai and Rapoport,2002；Fujinaga et al.,2003)。

由于霍乱毒素B亚基(CTB)是霍乱毒素无毒性细胞结合部位，易于与细胞膜表面GM1受体结合(Merritt et al.,1994)而进入细胞的特性，且神经组织中GM1含量较为丰富，因此CTB常作为一种经典神经环路示踪分子载体且具有高灵敏度，与特定探针连接后，即可作为一种示踪剂。在神经磁共振成像(MRI)中，已经有研究CTB与DOTA-Gd共价连接后作为造影剂，具有特异性，信号增强，并且可稳定存在一周以上(Wu,C.W.-H.,et al.2011.)。更重要的是，CTB可作为配体与不同物质结合制备新型神经示踪剂，这些研究都显示CTB在神经解剖学示踪剂的发展中的广泛应用价值。

大量研究结果表明，霍乱毒素B亚基(CTB)不具有毒性，但仍有很强的免疫原性，口服后能产生较高的抗体效价，现在已被用于开发作为霍乱弧菌的保护性疫苗。同时CTB也具有较强的免疫佐剂活性，可以作为抗原输送载体使用，抗原分子与CTB融合后与肠相关淋巴组织细胞表面的GM1具有很强的亲和力，有利于抗原的传递和免疫识别。对于一些通过吸附粘膜侵入机体的病原体，通过粘膜途径给药的疫苗比皮下注射疫苗更具有优势，因此粘膜佐剂的研究对于开发口服、鼻饲等通过粘膜给药的疫苗具有重要意义。

另外，已有研究证实霍乱毒素能在体外诱导大鼠和人的脑癌细胞分化为正常细胞(Li,Y.,et al.2007.)，对引起恶性高血压的肾上腺髓质瘤细胞也有逆转作用，该研究意味着霍乱毒素在特定癌症治疗方面有了新的应用价值。

天然霍乱毒素来源于霍乱弧菌，由于霍乱弧菌的高传染性，对于普通生化实验室无法直接通过大量培养霍乱弧菌提取天然霍乱毒素，而商业化的霍乱毒素价格昂贵，纯度有限，且通常只是非标记样品，无法充分满足实验室研究及各种标记方法发展需要，也难以对毒素进行改造以扩展其应用，特别是神经环路的示踪。因此原核重组高效表达具有生物活性的霍乱毒素显得十分必要。虽然文献中也有多次报道CTB体外表达，包括原核，真核表达，但表达量并不高，所得到的蛋白是否具有生物活性也并不清楚。

本发明就是利用原核表达载体，在大肠杆菌中大量表达霍乱毒素亚基，然后在体外进行高效复性，得到大量具有生物活性的霍乱毒素B亚基，普通实验室均可操作，无污染。最重要的优点是，可以根据实验需求，进行各种荧光，同位素，示踪剂标记。