[发明专利]一种人血浆中他达拉非的定量分析方法

说明书

本发明公开了一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，包括如下步骤：（1）标准工作溶液的配制；（2）样品处理；（3）标准曲线制作；（4）定量分析：将试验样品按照步骤（3）的方法处理，并按步骤（3）所得的标准曲线方程计算，得到试验样品中他达拉非的浓度。本发明应用液质联用技术(HPLC‑MS/MS)测定人血浆中他达拉非的浓度，准确定量人血浆中他达拉非的浓度，通过色谱柱、溶解液、流动相、质谱条件等的合理选择，流速、洗脱方式、质谱条件等工艺条件的优化，操作简便，重复性高，准确性好，可操作性强，可以直接运用于生物等效性中样品检测分析。

技术领域

本发明属于生物分析领域，更具体地，涉及一种应用液质联用技术(HPLC-MS/MS)对人血浆中他达拉非的定量分析方法。

背景技术

据估计，全世界范围内有超过1.5亿的勃起功能障碍(ED)患者，随着全球人口老龄化，ED患者的数量还将不断攀升。他达拉非片是环磷酸鸟苷(cGMP)特异性磷酸二酯酶5(PDE5)的选择性可逆抑制剂，当性刺激导致局部释放一氧化氮，PDE5受到他达拉非抑制，使阴茎海绵体内cGMP水平提高，这导致平滑肌松弛，血液流入阴茎组织，产生勃起，如无性刺激。2013年底，礼来在中国推出了每日一次的5mg小剂量口服剂型的希爱力(他达拉非)，相同疗效，价格仅万艾可(西地拉非)的三分之一。中国仿制药市场强大的需求，既便宜又效果质量不错的药品需求可以减轻经济负担。开发他达拉非的生物检测方法并应用于他达拉非的仿制药一致性评价具有广阔的前景。

仿制药一致性评价中，如何确定更好更稳定的进行生物等效性评价，药物的检测分析显得非常重要。他达拉非生物样品的成分复杂、基体干扰大，同时样品较难获得而且量少，被分析物的浓度通常很低，因此对生物样品分离分析技术提出的要求越来越高，亟需建立一种高灵敏度、高选择性的他达拉非含量分析方法。

发明内容

本发明针对上述现有技术中的不足，从样品前处理和检测技术两方面着手，提供了一种人血浆中他达拉非的定量分析方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取他达拉非，加入体积比9:1的甲醇-二甲亚砜溶液配制成浓度为0.100～5.000mg·mL^-1的他达拉非储备液，将所述他达拉非储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成梯度浓度为40.0～40000ng·mL^-1的他达拉非工作溶液；按上述步骤重复一次，配置成梯度浓度为40.0～320000ng·mL^-1的他达拉非平行工作溶液；称取他达拉非-d3，加入体积比9:1的甲醇-二甲亚砜溶液配制成浓度为0.050～2.000mg·mL^-1的内标储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成300～500ng·mL^-1的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在0～10℃下保存，备用；

取空白人正常血浆，分别加入所述他达拉非工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，其浓度范围为2.00～2000ng·mL^-1；取空白人正常血浆，分别加入所述他达拉非平行工作溶液，混匀，配置成相应梯度的质控样品，其梯度浓度范围为2.00～16000ng·mL^-1；

(2)样品处理：取等体积的校正标样、质控样品、试验样品、空白人血浆和水，往校正标样、质控样品、试验样品中分别加入等体积的所述内标工作溶液，往空白人血浆和水分别加入等体积的甲醇水溶液；向上述每个混合液中加入乙腈，混匀，离心，转移上清液至甲醇水溶液中，混匀，将各提取物保存；

(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到校正标样、质控样品的提取物进行LC-MS/MS分析测定，以他达拉非和内标他达拉非的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中他达拉非的浓度为横坐标制作标准曲线；