[发明专利]一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法

权利要求书

1.一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取熊去氧胆酸对照品至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为2～10mg·mL-1的熊去氧胆酸储备液，将所述熊去氧胆酸储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为0.1～5000μg·mL-1的熊去氧胆酸工作溶液；称取一定量的内标熊去氧胆酸-d4至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为0.300～0.800mg·mL-1的内标储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成200～600ng·mL-1的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在0～10℃下保存，备用；

(2)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μL人血浆样品，向样品中加入步骤(1)所述的内标工作溶液，然后加入乙腈沉淀剂，涡旋混合，于3～8℃的离心机中高速离心3～5分钟；取上清液并向上清液中加入体积比1:1的甲醇水溶液，涡旋混合3～5分钟，进行LC-MS/MS分析；

(3)标准及曲线配制过程：等量取步骤(1)所述各浓度熊去氧胆酸工作溶液，分别加入到犬空白血浆中涡旋混匀，配制成校正标样及随行质控样品，然后分别注入LC-MS/MS中进行测定，以熊去氧胆酸和内标熊去氧胆酸-d4的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中熊去氧胆酸的浓度为横坐标制作标准曲线；

(4)LC-MS/MS测定过程：根据标准曲线计算人血浆样品中的熊去氧胆酸浓度。

2.根据权利要求1所述的一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，其特征在于：所述LC-MS/MS测定过程工作条件为：

a.液相色谱条件：色谱柱为UItimateXB C18；流动相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸铵的水溶液；流动相B：乙腈；柱温箱温度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；色谱柱平衡状态时的柱压：20.0～24.0MPa；洗脱方式为梯度洗脱；

b.质谱条件：离子源为ESI源，采用负离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：-5000～-4000V；涡旋离子喷雾温度：550～650℃；气帘气种类：30psi；碰撞池气体：中级；雾化气种类Gas1：40psi；辅助气Gas 2：50psi；数据收集时间：3～6min。

3.根据权利要求1所述的一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，其特征在于：步骤(2)所述离心机转速≥10000×g。

4.根据权利要求1或2所述的一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS测定过程中熊去氧胆酸的监测离子对为391.2/391.2，每次扫描一个离子对时所停留的时间200msec，去簇电压-137eV，碰撞能量-5.00eV。

5.根据权利要求1或2所述的一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS测定过程中内标熊去氧胆酸-d4的监测离子对为395.3/395.3，每次扫描一个离子对时所停留的时间100msec，去簇电压-32.0eV，碰撞能量-13.0eV。

6.根据权利要求1所述的一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，其特征在于：步骤(3)所述校正标样有8～10个，浓度为20.0～20000ng·mL^-1。

7.根据权利要求1所述的一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，其特征在于：步骤(3)所述随行质控样品由低、中、高及DQC的四个浓度组成；其中所述DQC随行质控样品浓度为10000ng·mL-1，稀释因子为10。

8.根据权利要求2所述的一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：自动进样器清洗溶液为甲醇，压脚提升量：48mm；自动进样器温度：4.0℃；自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；自动进样器洗针体积：400μL；自动进样器进样针清洗时浸泡时间：2seconds；自动进样器进样体积：15.0μL。