[发明专利]一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析技术领域，具体涉及一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法。

背景技术

熊去氧胆酸(ursodexycholic acid)是一种亲水胆汁酸，在生理情况下，熊去氧胆酸占人体胆汁酸的比例不超过2％。研究表明，熊去氧胆酸能有效溶解胆固醇性结石，有利胆、保护肝细胞和免疫调节等作用，长期服用能够增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解，可明显缓解症状，改善脂肪肝影像学表现，用于不宜手术治疗的胆固醇结石，对脂肪肝具有较好疗效，而且不良反应轻，使用安全；对结肠癌化疗引起的腹泻、预防和治疗肝移植术后急性排斥反应、各种肝病的辅助治疗、胆汁返流性胃炎和原发性胆汁性肝硬化的治疗等有较好疗效，被广泛用于临床多种肝胆疾病的治疗。

由于液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)法可以克服背景干扰，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度，且具有分辨率高、质量范围宽、扫描快等优点，LC-MS/MS已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。为此本发明建立了一种快速、灵敏的LC-MS/MS方法定量检测人血浆中熊去氧胆酸的浓度，并将该方法应用于熊去氧胆酸的药物代谢动力学研究，为熊去氧胆酸的临床研究奠定技术基础。因此建立熊去氧胆酸的LC-MS/MS分析方法，有助于服务制药企业，缩短其一致性评价的研究周期，高效严谨便捷准确的进行样品分析。使老百姓吃到安全，有效又便宜的药。

建立通用、简单、快捷、准确的熊去氧胆酸血浆样品分析定量检测方法，有助于准确快速的研究该化合物的药代动力学特征，获得相应的PK参数，为熊去氧胆酸的一致性评价建立基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，该方法采用沉淀前处理、LC-MS/MS质谱仪进行测定，操作简单、分离效果好、定性准确、样品分析时间短、检测灵敏度高。

本发明的技术方案为：一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取熊去氧胆酸对照品至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为2～10mg·mL-1的熊去氧胆酸储备液，将所述熊去氧胆酸储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为0.1～5000μg·mL-1的熊去氧胆酸工作溶液；称取一定量的内标熊去氧胆酸-d4至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为0.300～0.800mg·mL-1的内标储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成200～600ng·mL-1的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在0～10℃下保存，备用；

(2)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μL人血浆样品，向样品中加入步骤(1)所述的内标工作溶液，然后加入乙腈沉淀剂，涡旋混合，于3～8℃的离心机中高速离心3～5分钟；取上清液并向上清液中加入体积比1:1的甲醇水溶液，涡旋混合3～5分钟，进行LC-MS/MS分析；

(3)标准及曲线配制过程：等量取步骤(1)所述各浓度熊去氧胆酸工作溶液，分别加入到犬空白血浆中涡旋混匀，配制成校正标样及随行质控样品，然后分别注入LC-MS/MS中进行测定，以熊去氧胆酸和内标熊去氧胆酸-d4的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中熊去氧胆酸的浓度为横坐标制作标准曲线；

(4)LC-MS/MS测定过程：根据标准曲线计算人血浆样品中的熊去氧胆酸浓度。

进一步地，所述LC-MS/MS测定过程工作条件为：

a.液相色谱条件：色谱柱为UItimateXB C18；流动相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸铵的水溶液；流动相B：乙腈；柱温箱温度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；色谱柱平衡状态时的柱压：20.0～24.0MPa；洗脱方式为梯度洗脱；

b.质谱条件：离子源为ESI源，采用负离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：-5000～-4000V；涡旋离子喷雾温度：550～650℃；气帘气种类：30psi；碰撞池气体：中级；雾化气种类Gas1：40psi；辅助气Gas 2：50psi；数据收集时间：3～6min。

优选地，步骤(2)所述离心机转速≥10000×g。

优选地，所述LC-MS/MS测定过程中熊去氧胆酸的监测离子对为391.2/391.2，每次扫描一个离子对时所停留的时间200msec，去簇电压-137eV，碰撞能量-5.00eV。