[发明专利]一种用于高效快速扩增cDNA末端的锚定引物及扩增方法

说明书

本发明公开一种用于高效快速扩增cDNA5’及3’末端的锚定引物，所述两种锚定引物可特异性结合于靶核酸序列并引发反转录延伸反应，从而高效快速扩增出cDNA5’及3’末端，尤其可应用于低丰度转录本中cDNA的5’和3’末端快速扩增。另外，本发明还提供一种高效快速扩增cDNA5’及3’末端的试剂盒及扩增方法。

技术领域

本发明涉及一种cDNA末端的快速扩增方法，特别涉及一种用于高效快速扩增cDNA末端的锚定引物及扩增方法。

背景技术

全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典的 RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术是由Frohman等于1988年发明的一项技术，该技术可以有效获得基因的全长序列。RACE基于RT-PCR技术，末端加入锁定引物从RNA中获取带有与末端锁定引物互补或相同序列的cDNA，再通过特异性引物进行PCR扩增从而获得完整的cDNA5'和3'端序列。RACE技术原理简单，它具有快捷、高效、廉价等优点。

在很多生物研究中，所研究的目的基因丰度往往很低，这种情况下传统的 RACE技术就突显其不足，如特异性差，扩增效率低等，因此从低丰度mRNA 通过转录获得全长cDNA变得异常困难。因此，本领域迫切需要开发快捷、效率高、特异性好的cDNA 5’及3’末端扩增技术。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于高效快速扩增cDNA末端的锚定引物，所述锚定引物可特异性结合于靶核酸序列并引发反转录延伸反应，从而高效快速扩增出cDNA 5’及3’末端。另外，本发明还提供一种高效快速扩增cDNA’末端的试剂盒及扩增方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种用于高效快速扩增cDNA 5’末端的锚定引物，所述5’末端锚定引物的序列末端含3个鸟嘌呤,其中前两个鸟嘌呤为单脱氧鸟嘌呤，最末端的一个鸟嘌呤为锁核酸修饰鸟嘌呤。

优选的，所述5’末端锚定引物的序列自身形成3’末端部分突出的茎环状结构。

优选的，所述5’末端锚定引物的序列与所有物种转录本不存在特异性结合区。

优选的，所述5’末端锚定引物的序列末端与cDNA 5’末端的胞嘧啶碱基互补配对，待M-MLV反转录酶合成cDNA至末端时，以所述5’末端锚定引物作为模板进行延伸。

优选的，所述5’末端锚定引物的序列为：ATGCAGACGATTCTACGCT GTGTTCTArGrG+G。采用此5’末端锚定引物的序列，可扩增出一段长链非编码RNA的全长cDNA，其UCSC数据库的登录号为TCONS_00027227，自命名为27227,其染色体定位position:chr19:22025306-22035178。

另一方面，本发明提供一种高效快速扩增cDNA末端的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1～5任一项所述的5’末端锚定引物以及3’末端锚定引物。

优选的，所述高效快速扩增cDNA末端的试剂盒中的3’末端锚定引物序列末端连接30个dT，并且所述3’末端锚定引物序列自身不形成发夹结构；且锚定引物序列与所有物种转录本不存在特异性结合区。

优选的，所述3’末端锚定引物序列为CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC-(dT) 30。

另一方面，本发明提供一种高效快速扩增cDNA的方法，所述方法包括以下步骤：(1)、扩增目的基因的5'末端的cDNA片段，得到5'末端的RACE产物； (2)、扩增目的基因的3'末端的cDNA片段，得到3'末端的RACE产物；(3)、从步骤(1)和步骤(2)中获得的2个有相互重叠序列的3'及5'末端的RACE 产物中获得全长cDNA，或通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。