[发明专利]一种动物全身性表达重组人溶菌酶的方法

权利要求书

1.一种动物全身性表达重组人溶菌酶的方法，其特征在于第一步：人溶菌酶BAC克隆选择Genome Systems公司的GenBank号为RP11-72P21作为目标hLZ BAC克隆，该hLZ BAC克隆含有155kb 5’调控区—CPSF6冗余基因，4.8kb hLZ基因组序列和6kb 3’调控区；

第二步：冗余基因CPSF6的去除：为避免冗余基因CPSF6对hLZ基因的干扰，通过重组方法去除冗余基因CPSF6，具体步骤如下：

（1）hLZ BAC克隆通过电转染方法转入SW102菌株（该菌株已转入了Red重组系统所需要的exo蛋白、bet蛋白、gam蛋白）；SW102菌株是美国国立卫生研究院生物资源分部提供，

（2）选择CPSF6冗余基因外显子1为重组置换区域，设计同源臂，以pBR322-loxP-Neo质粒设计引物扩增loxP-Neo基因片段，同时将同源臂和引物连接，获得包含如下重组引物的PCR产物，F-Neo：5’-TCT CTG AGG ATG CAG AAA CAA GAC ATT GTT TTT GGT CAT ACG CCG TTC ACA GAA TGC CCG CCG CCT CCA TCC AGT CTA TT -3’；R-Neo：5’-TTA TCT GTG GCT CCA AAA GTC AAA GGA CTT GTT GCA AAT GAG CCC GCA CCT CAG TCG CCT GTC GCC GCA TAC ACT ATT CT-3’，其中，CG CCT CCA TCC AGT CTA TT和GTC GCC GCA TAC ACT ATT CT为引物，其他为同源臂，

（3）重组引物所得到的PCR产物，切胶回收后，电击转入含有含hLZ BAC的SW102菌株中，发生重组，获得去除冗余基因的人溶菌酶pBAC-hLZ-Neo。

2.根据权利要求1所述的动物全身性表达重组人溶菌酶的方法，其特征在于A、 SW102菌株的电转化感受态制备

a．初始培养，用枪头挑取SW102菌株单克隆，加入盛有5ml LB培养基的灭菌管中，32℃，220rpm，过夜培养；

b．扩大培养，将过夜培养液按大约1:70的比例转移到盛有50ml LB培养基的灭菌三角瓶中，32℃，220rpm，待OD600达到0.4时，停止培养；

c．将菌液平均分成2份，第一份于42℃（严格）水浴，220rpm，振荡孵育15min；第二份为对照，32℃水浴，220rpm，振荡孵育15min；

d．将2份菌液在冰水浴中快速冷却10min以上，之后于4℃，5000rpm离心10min；

e．弃上清，重新将管置于冰水浴中，加入1ml冰上预冷的ddH2O，轻轻转动重悬，再加入10ml预冷的ddH2O，快速倒转几次，4℃，5000rpm离心5min；

f．弃上清，重新将管置于冰水浴中，加入1ml冰上预冷的10%甘油+90% ddH2O，轻轻转动重悬，再加入10ml预冷的10%甘油+90% ddH2O，快速倒转几次，4℃，5000rpm离心5min；

g．弃上清，加入100-200 μL预冷的10%甘油+90% ddH2O，重悬沉淀；

h．分装，每0.5ml的小管中加入40μl，液氮速冻后-80℃保存，备用，该保存、备用物即为感受态细胞；

B、 感受态细胞与PCR产物的电转化

a．取40 μl含有hLZ BAC克隆的感受态细胞与5μl 的PCR产物混合，然后将混合物转移至冰浴充分的0.2 cm电击杯中，注意不能形成气泡；

b．将电击杯周围的水擦干，置于电击槽中，启动细菌的电击程序；

c．听见“噗”的一声后，电击转化结束，向电击杯中加入0.8ml SOC培养基，用枪吸出，置于1.5ml 离心管，32℃水浴振荡恢复培养2小时；

d．涂布于含有相应的抗生素的LB板上，32℃培养箱中培养过夜；

e．PCR和Cracking法鉴定阳性克隆；

C、带有同源臂的PCR长片段引物设计

带有同源臂的长片段引物一般结构为：在普通PCR引物的5’端各带上大约50-60bp的同源序列，并可在同源臂和普通引物之间引入酶切位点等序列，修饰hLZ BAC克隆同源臂的设计如下：选取目标序列的5’端紧邻约50-60bp序列作为5’同源臂，加到一条普通引物的5’端；选取目标序列的3’端紧邻约50-60bp序列，取其反向互补序列加到另一条普通引物的5’端，作为3’同源臂；

D、 阳性克隆的PCR和测序法鉴定

使用P-Neo杂合引物（F：5’-CGC CAG AGA CAA CCT ACT GT-3’和R：5’- GTC GCC GCA TAC ACT ATT CT -3’）鉴定重组后的阳性克隆菌株，如果发生了重组则可扩增出2.5 kb的条带，未发生重组的菌株不能扩增出条带（图1.B）；

PCR产物进一步测序，和原序列比对后发现，重组后产生的DNA置换位点和目标设计完全一致（图1.C）；人溶菌酶全身性表达载体pBAC-hLZ-Neo构建完成。