[发明专利]一种动物全身性表达重组人溶菌酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过重组而获得新的基因的技术。

背景技术

溶菌酶，又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

目前，与人类生活密切相关的溶菌酶主要鸡蛋清溶菌酶，广泛来源于禽类的蛋清，其来源广泛，纯化工艺简单，是认识最为清楚，也是唯一得到工业化应用的溶菌酶，但存在过敏性和活性低等缺点。

人溶菌酶（hLZ）是溶菌酶家族的成员之一，作为人体的非特性免疫物质之一，人溶菌酶在全身粘膜组织中广泛表达，包括泪液、唾液、鼻粘液、尿液、消化液、汗水及人的乳汁，发挥着抗菌消炎的重要功能。同时作为一种免疫因子，人溶菌酶尤其在中性粒细胞和巨噬细胞的分泌物中发挥作用。

相比蛋清溶菌酶，人溶菌活性最高，为鸡蛋清溶菌酶的3倍，有更高的热稳定性，无过敏性，临床应用时无刺激性及副作用等突出优点，开发潜力巨大。但是，目前人溶菌酶来源渠道狭小，主要来源于母乳和血液的提纯，限制了其产业化应用。

通过基因工程技术，重组人溶菌酶已在酵母、植物和转基因动物乳腺中等系统中获得表达，其中以转基因动物乳腺表达最为突出。1994年Mega等首先进行了转基因小鼠乳腺表达人溶菌酶的研究，他们利用alpha s1 酪蛋白启动子来诱导溶菌酶的表达，表达量为0.2到0.7克/升；1998年，Mega等的研究结果进一步表明转基因小鼠表达人溶菌酶的奶样具有同标准溶菌酶相同的活性。这些结果暗示着溶菌酶的转基因研究在乳品加工业有着巨大的应用前景。2006年，国内首次利用体细胞克隆的方法获得了乳腺特异性表达重组人溶菌酶的转基因牛。虽然如此，已有技术所获得的人溶菌酶主要是乳腺表达，而不能实现身体多个部位的表达。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种能在动物体多个组织中全身性表达重组人溶菌酶的方法。

本发明是这样实现的，

hLZ BAC克隆，GenBank号为RP11-72P21，含有人溶菌酶基因组序列和完整的调控序列（来源于Genome Systems公司）；

SW102菌株、PL452质粒（来源于美国国立卫生研究院生物资源分部）；

Taq DNA聚合酶购于大连TaKaRa公司，引物合成及序列测定由上海生工完成；兔抗人溶菌酶多克隆抗体购自US Biological公司，人溶菌酶ELISA检测试剂盒购于Biomedical Technologies公司；酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤采用《分子克隆（第三版）》的技术，

第一步：人溶菌酶BAC克隆选择Genome Systems公司的GenBank号为RP11-72P21作为目标hLZ BAC克隆，该hLZ BAC克隆含有155kb 5’调控区—CPSF6冗余基因，4.8kb hLZ基因组序列和6kb 3’调控区；

第二步：冗余基因CPSF6的去除：为避免冗余基因CPSF6对hLZ基因的干扰，通过重组方法去除冗余基因CPSF6，具体步骤如下：

（1）hLZ BAC克隆通过电转染方法转入SW102菌株（该菌株已转入了Red重组系统所需要的exo蛋白、bet蛋白、gam蛋白）；SW102菌株是美国国立卫生研究院生物资源分部提供，