[发明专利]一种产高活力单宁酶菌株的制备方法

权利要求书

1.一种产高活力单宁酶菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取2 g角倍，用5 mL dd水冲洗，收集冲洗液至50 mL三角瓶中，用dd水定容并摇匀，得到10^-1的菌溶液，梯度稀释至10^-10，各梯度菌溶液于筛选培养基上涂平板2个，28 ℃恒温培养60 h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落，分别接于PDA斜面活化84 h；

（2） 将活化后的PDA斜面上的孢子，用dd水配成2×10⁶ 个/mL的孢子液，然后接种l mL于50 mL固态发酵培养基中，28 ℃恒温培养84 h，然后进行单宁酶提取及酶活力测定，通过比较酶活力确定产单宁酶活力最高的菌株。

2.根据权利要求1所述的产高活力单宁酶菌株的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述筛选培养基由以下组分配制而成：硝酸铵1.20 g，氯化锰0.025 g，七水硫酸镁0.005 g，磷酸二氢钾0.005 g，琼脂28.00 g，单宁酸2.50 g，用dd水溶解后定容至1 L。

3.根据权利要求1所述的产高活力单宁酶菌株的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述固态发酵培养基由以下组分配制而成：麸皮9.25 g，单宁酸0.75 g，硝酸铵1.20 g，氯化锰 0.025 g，七水硫酸镁0.005 g，磷酸二氢钾0.005g，用dd水溶解后定容至1 L。

4.根据权利要求1所述的产高活力单宁酶菌株的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述单宁酶提取及酶活力测定方法，包括以下步骤：

a、往发酵结束后的三角瓶中加入100 mL dd水，28 ℃，150 r/min振荡30 min，然后将混合液倒出，用四层纱布过滤，将滤液收集并于5000 r/min离心10 min，收集上清液即为单宁酶酶液；

b、取5支2 mL的EP管，设定1支对照管、1支空白管及3支测定管；每管加入0.3 mL酶液，45 °C金属浴恒温15 min；然后各测定管加入0.1 mL 没食子酸丙酯标准液，空白管中加dd水0.1 mL，对照管加95%乙醇0.6 mL，反应20 min；然后测定管和空白管分别加95%乙醇0.6 mL以终止酶促反应；对照管加没食子酸丙酯标准液0.1 mL；冷却后，将各管溶液稀释10倍；275 nm波长处测定各管溶液吸光度值。

5.根据权利要求4所述的产高活力单宁酶菌株的制备方法，其特征在于，所述没食子酸丙酯标准液配制方法为：准确称取0.4244 g没食子酸丙酯，用dd水定容至1000 mL，即得2 mmol/L的没食子酸丙酯标准液。