[发明专利]一种产高活力单宁酶菌株的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及微生物筛选、菌种鉴定及发酵产酶相关领域，特别是提供了一种产高活力单宁酶菌株及其制备方法。

背景技术

单宁酶（Tannase, E.C. 3.1.1.20），即单宁酰基水解酶，是一种诱导型细胞膜结合酶，可水解没食子酰单宁及没食子酸烷基酯，生成没食子酸、葡萄糖及烷基醇等小分子物质。

基于对单宁物质的高效水解作用，单宁酶在食品、饮料、酿酒、医药、化工、制革及污水处理等领域得到了广泛的应用研究，并已商业化用于去除速溶茶生产中的“茶乳酪”沉淀物。然而，由于目前单宁酶生产效率普遍较低，生产成本较高，因而高昂的市场价格限制了单宁酶的规模化工业应用。

经文献查新得知，目前单宁酶主要通过微生物发酵生产，尤其对曲霉和青霉发酵生产单宁酶的报道较多。但目前存在着这些微生物大多产酶不高，尤其是国内对产高活力单宁酶菌株缺乏自主知识产权等问题。本申请的发明人早前申请的CN201310153857.2报道了一种菌株黑曲霉T3-5-1， CN201410121620.0报道了一种菌株黑曲霉N5，二者生产单宁酶均采用的是液态发酵技术，其中黑曲霉T3-5-1所产单宁酶比活力为5304.53 U/mg，比美国Sigma公司所产单宁酶的比活力（1788.15 U/mg）高3516.38 U/mg，黑曲霉N5所产单宁酶比活力为6546.78 U/mg，比美国Sigma公司所产单宁酶的比活力（3185.25 U/mg）高3361.53 U/mg。但上述液态发酵生产的单宁酶主要为胞内酶，因此提酶之前需要先做细胞破壁处理，使单宁酶流出后再提取，工艺相对复杂，而且所产单宁酶比活力也有待进一步提高。

发明内容

本发明目的是针对以上存在的问题，提供一种产高活力单宁酶菌株的制备方法，从而提高发酵单宁酶活力，解决当前单宁酶工艺相对复杂、生产效率较低的问题。

本发明筛选出的一株产高活力单宁酶菌株，经菌种鉴定为黑曲霉（Aspergilluse niger），命名为黑曲霉N5-5，2014年2月28日起，由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保存，保藏编号CCTCC NO：M 2014051。

本发明菌株的制备方法包括以下步骤：

（1）取2 g角倍，用5 mL dd水冲洗，收集冲洗液至50 mL三角瓶中，用dd水定容并摇匀，得到10^-1的菌溶液，梯度稀释至10^-10，各梯度菌溶液于筛选培养基上涂平板2个，28 ℃恒温培养60 h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落，分别接于PDA斜面活化84 h；

（2）将活化后的PDA斜面上的孢子，用dd水配成2×10⁶个/mL的孢子液，然后接种l mL于50 mL固态发酵培养基中，28 ℃恒温培养84 h，然后进行单宁酶提取及酶活力测定，通过比较酶活力确定产单宁酶活力最高的菌株。

步骤（1）中，所述筛选培养基由以下组分配制而成：硝酸铵1.20 g，氯化锰0.025 g，七水硫酸镁0.005 g，磷酸二氢钾0.005 g，琼脂28.00 g，单宁酸2.50 g，用dd水溶解后定容至1 L。

步骤（2）中，所述固态发酵培养基由以下组分配制而成：麸皮9.25 g，单宁酸0.75 g，硝酸铵1.20 g，氯化锰 0.025 g，七水硫酸镁0.005 g，磷酸二氢钾0.005g，用dd水溶解后定容至1 L。

步骤（2）中，所述单宁酶提取及酶活力测定方法，包括以下步骤：

a、往发酵结束后的三角瓶中加入100 mL dd水，28 ℃，150 r/min振荡30 min，然后将混合液倒出，用四层纱布过滤，将滤液收集并于5000 r/min离心10 min，收集上清液即为单宁酶酶液。

b、取5支2 mL的EP管，设定1支对照管、1支空白管及3支测定管。每管加入0.3 mL酶液，45 °C金属浴恒温15 min。然后各测定管加入0.1 mL 没食子酸丙酯标准液，空白管中加dd水0.1 mL，对照管加95%乙醇0.6 mL，反应20 min。然后测定管和空白管分别加95%乙醇0.6 mL以终止酶促反应。对照管加没食子酸丙酯标准液0.1 mL。冷却后，将各管溶液稀释10倍。275 nm波长处测定各管溶液吸光度值。