[发明专利]基于体外定点突变获得的油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因及应用

权利要求书

1.一种基于体外定点突变获得的油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因，其特征在于，该基因mALS₃是利用体外定点突变技术获得的，是在授权专利ZL201310111739.5公开的抗除草剂油菜M342的ALS₃基因序列中引入一个新的突变位点，该位点位于ALS₃基因的第560位，原来是C碱基，编码187位的丙氨酸，经突变成T碱基后则在187位变成了缬氨酸，该基因mALS₃序列为：SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述一种基于体外定点突变获得油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS₃的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，是指所述油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS3在植物抗ALS抑制剂类除草剂方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述ALS抑制剂类除草剂是指咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑嘧啶磺酰胺类或嘧啶水扬酸类除草剂。

5.根据权利要求4所述的应用，所述ALS抑制剂类除草剂是指咪唑乙酰胺、苯磺隆、双氟磺酰胺或双草醚除草剂。

6.根据权利要求3所述的应用，是指所述油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS3在拟南芥抗ALS抑制剂类除草剂方面的应用，具体为：

1)引物设计：

2)抗除草剂油菜ALS₃基因克隆：以抗除草剂油菜M342基因组DNA为模板，用引物对ALSF/ALSR及高保真DNA聚合酶扩增油菜的ALS₃基因：

扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA1μl，10μM 35-S-ALSF1μl，10μM ALSR 1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH₂O到50μl；

温度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35个循环后，72℃，5min,琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，胶回收纯化2Kb的PCR产物并克隆到peasy-T1载体上经测序确定，获得克隆有抗除草剂油菜M342ALS₃基因的peasy-T1质粒；

3)利用重叠PCR引入碱基突变

以克隆有抗除草剂油菜M342的ALS₃基因的peasy-T1质粒为模板，分别用引物对ALSF/ALSRm和ALSFm/ALSR扩增出上游片段572bp和下游片段1412bp；

扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH₂O到50μl；

温度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35个循环后，72℃，5min；

琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物分别回收大小约572bp和1412bp的上、下游PCR产物后,以上、下游产物的混合物为模板，用引物对ALSF/ALSR扩增出全长的ALS₃基因序列；

扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH₂O到50μl；

温度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35个循环，72℃，5min；

琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物分别回收大小约2000bp的片段，然后克隆到peasy-T1上，并测序分析，该产物序列除了在560处引入了点突变C/T外，其余碱基序列与M342的ALS₃基因序列完全一致，定名为mALS₃；

4)植物表达载体构建：以载体pCAMBIA2300质粒DNA为模板，分别用引物对p0390-35SF/35SR和ALS-nosF/nosp0390R扩增35S启动子序列450bp和nos终止子序列250bp，胶回收相应大小的PCR产物；

以克隆有mALS₃基因的peasy-T1质粒为模板，用引物对35S-ALSF/ALSR扩增mALS₃基因，胶回收大小约2000bp的PCR产物，通过重组反应克隆到smalI酶切线性化的pCAMBIA0390载体上:

反应体系如下：5×CE Multis buffer 4μl，mALS₃PCR产物2μl，35S PCR产物2μl，nos PCR产物2μl，Exnase^TM 2μl，线性化载体4μl,ddH₂O 2μl，于37℃下反应30min，后取5-10μl反应液转化大肠杆菌DH5α，挑克隆PCR鉴定，抽提质粒酶切鉴定，最终经测序确定后，由此获得的质粒定名为p0390-mALS₃；

5)拟南芥转化:用上述获得的植物表达载体质粒p0390-mALS₃转化农杆菌GV3101，采用农杆菌液浸花的方法转化拟南芥；

6)抗除草剂拟南芥植株的筛选：播种经含质粒p0390-mALS₃农杆菌GV3101转化处理的拟南芥T₀代种子，在苗期进行ALS抑制剂类除草剂的抗性鉴定，经过除草剂筛选，获得抗除草剂植株。