[发明专利]基于体外定点突变获得的油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因及应用在审

专利信息
申请号: 201710166233.2 申请日: 2017-03-20
公开(公告)号: CN107058350A 公开(公告)日: 2017-08-18
发明(设计)人: 陈松;浦惠明;彭琦;张洁夫;胡茂龙;付三雄;陈锋;周晓婴;龙卫华;高建芹;张维;王晓东 申请(专利权)人: 江苏省农业科学院
主分类号: C12N15/54 分类号: C12N15/54;C12N15/82;A01H5/00
代理公司: 南京经纬专利商标代理有限公司32200 代理人: 张素卿
地址: 210014 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 基于 体外 定点 突变 获得 油菜 多种 als 抑制剂 除草剂 基因 应用
【说明书】:

一、技术领域

发明涉及一种基于体外定点突变获得的油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因及应用,属于生物技术领域。

二、背景技术

田间杂草的生长一方面与农作物竞争养分和生长空间,给农作物正常生长发育带来严重影响;另一方面人工除草费时费工增加劳动成本。而现代农业生产中越来越多的依靠化学除草剂来防除杂草。然而,除草剂在杀死杂草的同时往往也对农作物带来不同程度的危害。因此,培育抗除草剂作物新品种对除草剂的推广应用和农作物的轻简化栽培均具有重要的现实意义。

除草剂主要是通过抑制或干扰植物关键的代谢过程而抑制植物生长或杀死植物。以氨基酸生物合成过程中的关键酶为靶标,是研发新型高效除草剂的一个重要方向和热点,已成功开发的除草剂的靶酶有乙酰乳酸合成酶、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)和谷氨酰胺合成酶(GS)等。美国孟山都(Monsanto)公司以EPSPS为靶酶开发的有机磷除草剂草甘膦,自1974年在美国注册登记以来,因其广谱、高效、低毒、易分解、低残留和对环境相对安全等优点在全球100多个国家得到应用。德国Hoechst公司以GS为靶酶开发的有机磷除草剂草铵膦在欧洲及北美被广泛使用。

而以乙酰乳酸合成酶(ALS)为靶酶开发的除草剂,己经成为新型高效除草剂的主流产品。ALS是催化分支氨基酸如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成第一步的酶。ALS抑制剂类除草剂能抑制植物细胞内的ALS酶活性,阻碍支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成,从而抑制植物细胞的分裂和生长。1961年美国杜邦(Du Pont)公司首先报道了嘧啶类化合物的活性及对植物体内ALS酶的抑制作用,1982年该公司成功研发了第一个磺酰脲类除草剂氯磺隆(Chlorsulfuron)。继氯磺隆研发成功以来众多国际化学公司以ALS为靶酶相继开发成功了咪唑啉酮类、磺酰胺类、嘧啶水杨酸类和三唑嘧啶磺酰胺类除草剂,具体的除草剂品种和商品名更是不计其数。以ALS为靶酶开发的除草剂具有选择性强、杀草谱广,活性高、使用剂量低,对哺乳动物毒性小等优点,既可作土壤处理剂也可茎叶喷施,因其除草效率高、使用方便深得广大用户欢迎。该类除草剂作用位点单一,长期使用极易让杂草产生抗药性,但同时也为诱变作物产生抗性、为选育非转基因抗除草剂品种提供了便利。

利用传统诱变技术如化学诱变剂处理种子可以诱导植物细胞ALS基因的碱基发生点突变,进而导致ALS酶蛋白的氨基酸发生替换,而变得对除草剂不在敏感。而更多的抗ALS类除草剂基因是来自一些杂草。由于大量使用这类除草剂,使得抗该ALS类除草剂的抗性生物型杂草数量急剧增加,据不完全统计全球30多个国家已经发现抗ALS抑制剂类除草剂的杂草生物型有98种,其中双子叶杂草68种,单子叶杂草30种,已成为产生抗性杂草最为严重的一类除草剂。研究表明抗ALS抑制剂类除草剂的杂草生物型中绝大多数是有靶标基因发生位点突变产生的。

如ALS酶蛋白第122位点(均以模式植物拟南芥ALS氨基酸位点计算)的丙氨酸被缬氨酸取代,对咪唑啉酮类除草剂产生抗性;第197位点的脯氨酸被组氨酸、或苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺取代,对磺酰脲类除草剂产生

迄今为止,在已经发现的ALS基因中,有8个位点,总计约26个氨基酸的替换突变会对相应的除草剂产生抗性。这8个位点分别是:Ala 122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654,这些位点所标注的数值均是相对于模式植物拟南芥的ALS酶蛋白氨基酸序列的位置。

除草剂抗性基因在培育抗除草剂农作物中得到广泛的应用。人们通过各种途径或技术手段分离获得除草剂抗性基因并转入到各种经济农作物中,以获得抗除草剂的农作物新品种。

目前在油菜中报道的ALS基因突变位点比较少,仅限于197位、574和653位的氨基酸替换。Swanson等通过诱变剂乙基亚硝基脲诱变油菜小孢子,选择获得了对咪唑啉酮类除草剂具有抗性的油菜Pl(或记为PMl)和P2(或记为PM2)。P1的抗性突变位点为BnALSl的Ser653Asp,P2的抗性突变位点是BnALS3的Trp574Leu,P2的抗性水平比P1高。目前国外已商业化的抗咪唑啉酮Clearfield油菜都是由这2个突变体转育而成。

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