[发明专利]一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶诱导的胸腺嘧啶切除修复：双链DNA底物中加入待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸和DNA聚合酶；所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶；通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N-糖苷键，从而剪切掉线性DNA探针上错配的胸腺嘧啶，产生一个脱碱基位点；然后核酸内切酶Ⅳ将对脱碱基位点进行剪切，从而导致线性探针3’端部分序列的断裂；

(2)尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增：在脱氧腺苷三磷酸，脱氧鸟苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸和聚合酶存在条件下，被切断的线性探针作为引物引发滚环扩增反应，产生包含尿嘧啶核苷酸的长片段重复序列；而后在尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶Ⅳ协助下，尿嘧啶被特异性切除，同时产生一个带羟基的3’末端以确保新的聚合延伸的循环；持续的聚合和尿嘧啶切除过程导致大量报告序列的生成；产生的报告序列随后与剩余的环形模板DNA结合以引发新一轮的聚合和尿嘧啶切除反应循环，最终生成大量报告序列；

(3)核酸内切酶Ⅳ介导的信号探针循环切割以及荧光分子的释放：加入信号探针，所述信号探针为荧光标记探针，所述信号探针上设计有且仅有一个四氢呋喃的无嘧啶位点，所述信号探针与报告序列结合，引发核酸内切酶Ⅳ介导的信号探针上的四氢呋喃的无嘧啶位点的循环切割，最终产生放大的荧光信号，对荧光信号进行检测，定量分析胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述线性探针的长度为32nt，所述线性探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’，其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶；X为2'，3'-二脱氧胞苷。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接，外切酶消化，纯化后所得；

其中，所述线性锁式探针的长度为57nt，所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTGTCG CGT TGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’；所述碱基序列中5’端的P为修饰的磷酸基团；

所述连接探针的长度为17nt，所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAGCG-3’；

所述信号探针的长度为26nt，所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT T-FAM-CC CXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’，其中FAM为修饰在T碱基上的荧光报告基团，BHQ1为修饰在T碱基上的荧光淬灭基团；X代表四氢呋喃无碱基位点。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用荧光分光光度计对荧光信号进行检测分析。

6.一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：双链DNA底物，核酸内切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸、DNA聚合酶、信号探针，其中所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶。