[发明专利]一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种用于检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，通过由胸腺嘧啶DNA糖基化酶引发、酶修复辅助的循环滚环指数扩增和核酸内切酶Ⅳ催化介导的循环切割实现实时检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的荧光方法；由于尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增和基于核酸内切酶Ⅳ的循环切割效率都很高，且尿嘧啶介导的指数扩增能极大地抑制非特异性扩增，因此该方法的检测灵敏度很高，经检测，所述方法对胸腺嘧啶DNA糖基化酶的检测下限可达5.6×10^‑7U/μL；同时，本发明利用胸腺嘧啶DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的自身修复特性，使整个修复反应严格按照自然修复机制进行，因此本方案的特异性很高。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法。

背景技术

胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)是体内碱基切除修复(BER)路径中非常重要的起始酶。在受损的基因组DNA中，其能特异性识别鸟嘌呤/胸腺嘧啶(G/T)和鸟嘌呤/尿嘧啶(G/U)的错配碱基对，并切除错配碱基胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。在DNA脱甲基化反应过程中，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)同样扮演着重要的角色。通过脱氨基-碱基切除修复反应，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)能高效地切除由十-十一转位(ten–eleven translocation，TETs)酶氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)所产生的5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。另外，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)还可以以配体依赖性方式与核受体(视黄酸受体(RAR)和类视黄醇x受体(RXR))相互作用，调节基因的表达。根据现有文献报道，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的异常表达会直接扰乱基因组DNA的修复、稳定的表观遗传以及正常的转录调节，从而引发包括癌症在内的多种疾病。因此，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的超灵敏检测不仅对基础生物化学的深入研究有很大帮助，而且对发展人类疾病新的治疗策略有重大意义。

迄今为止，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的检测方法仍然很少，其中凝胶电泳法是最普遍的方法，但是该方法存在检测灵敏度低、放射性污染、耗时较长等缺点。近年来，发展出了一些新的检测方法如荧光分析法和电化学分析法。通常在荧光分析法中，设计一对相距很近的荧光和淬灭分子，当胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)存在时，淬灭分子被释放，导致荧光分子发出荧光，最终通过检测荧光信号对酶活性进行定量分析；在电化学分析法中，有报道指出由DNA-量子点(QDs)聚合物超晶格结构的协助可以实现对目标检测物的三步信号放大，然而上述方法均存在灵敏度提高有限的问题。因此，发展一种新的方法用于快速、灵敏、特异性检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性是目前亟待解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提出一种检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的方法，该方法采用循环酶修复介导的双信号放大策略，具有灵敏度高、特异性好等优点。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明提供一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)诱导的胸腺嘧啶切除修复：双链DNA底物中加入待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸和DNA聚合酶；所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶；通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N-糖苷键，从而剪切掉线性DNA探针上错配的胸腺嘧啶，产生一个脱碱基(AP)位点；然后核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)将对脱碱基(AP)位点进行剪切，从而导致线性探针3’端部分序列的断裂；