[发明专利]一种固定化的荧光标记细胞色素c、其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种荧光标记的细胞色素c的固定化方法，以及所述固定化的荧光标记细胞色素c在生物样品检测中的用途。

背景技术

一氧化氮(NO)是具有多种生物活性的信使分子和效应分子，对心脑血管系统、消化系统、神经系统都具有重要的调节作用，近来研究表明NO还能发挥非特异性宿主防御作用，介导组织损伤、细胞凋亡等病理过程，进而引起炎症反应和自身免疫性皮肤病。NO虽然结构简单，但在有氧环境下极不稳定，检测难度大，因而相关分析方法的研究极大的关注，CN105153214提供了一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针、CN103923641提供了一种检测线粒体中一氧化氮的荧光探针。

细胞色素c是一种定位于线粒体内外膜间隙的血红素蛋白，广泛存在于各种含线粒体呼吸链的生物体中。细胞色素c含有c型血红素，能够与NO通过配位反应完成各种生理功能。早期的研究表明细胞色素c能够直接与NO结合与解离。

目前，发明人前期针对细胞色素c与NO反应机制的研究发现NO进入溶液以NO形式存在，使Cyt c周围的微环境发生变化，进入到Heme腔中改变其电子分布，增大了Met80与Heme之间的距离，使其相互作用减弱，Met与Heme之间的配位键改变，分子间发生重排，其中心Fe与NO形成新配位键，但所形成的Fe-N键不稳定，当NO量较少时，随时间变化又会断裂，再次生成五配位Fe，可以与溶液中的自由基团结合，最终达到一个平衡，当不断通入NO时，所形成的配位键不再发生断裂，破坏了其达到的平衡。

在对上述结合机制进行深入研究的基础上进一步发现，由于Cyt c与NO的配位反应伴随着空间构象的改变、配位键的形成，因此在不破坏细胞色素c结构和与NO结合活性的基础上，用荧光标记细胞色素c将能够用于检测细胞色素c与NO结合过程中的能量转移。

目前，国内外还没有利用固定化荧光标记的细胞色素c来检测一氧化氮的方法和产品。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种固定化的荧光标记细胞色素c，通过细胞色素c与NO的配位反应，引起细胞色素c构象的改变和能量的迁移，进而导致荧光光密度的改变，从而实现NO的检测。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

本发明提供一种荧光标记细胞色素c的固定化方法，包括以下步骤：

(1)从微生物中提取纯化细胞色素c；

(2)将细胞色素c与荧光素反应制备荧光标记的细胞色素c，除去游离荧光素；

(3)用异丙醇铝制备铝胶母液；

(4)将步骤(2)和(3)的产物混匀，涂布固相载体。

其中，所述细胞色素c来自光合细菌。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，所述细胞色素c包含的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，步骤(1)具体为：将菌体冻融后，超声破碎，上清液过离子交换色谱，洗脱液再过分子筛层析，获得电泳纯的细菌源细胞色素c。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，步骤(2)具体为：将1mg细胞色素c溶解于NaHCO₃溶液中，加入5μl 20mM的荧光素琥珀酰亚胺酯，混匀，4℃反应2h，0.01M的pH7.4磷酸盐缓冲液透析，除去未结合的游离荧光素二乙酸酯。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，步骤(3)具体为：取2g异丙醇铝，加入44ml沸水中，80℃搅拌45min，加入1.2mL 1M的HCl，煮沸1h，冷却至4℃。

所述荧光标记细胞色素c的固定化方法，步骤(4)具体为：取等量的步骤(2)和(3)的产物混匀，4℃反应1h，均匀涂覆于固相载体表面。

本发明第二个目的是：提供通过所述荧光标记细胞色素c的固定化方法制备的固定化荧光标记细胞色素c。

本发明第三个目的是：提供上述荧光标记细胞色素c的固定化方法在制备检测生物样品中NO的检测试剂中的用途。

本发明第四个目的是：提供上述荧光标记细胞色素c的固定化方法在制备检测生物样品中NO的检测装置中的用途。

本发明所述检测生物样品中NO的检测装置为细胞色素c珠、细胞色素c片、细胞色素c容器或细胞色素c传感器。