[发明专利]一种基因载体介导的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA及其用途

说明书

本发明提供一种用基因载体（包括但不限于9型腺相关病毒）介导的，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统直接编辑超氧化物歧化酶1（Superoxide Dismutase 1，简称SOD1）突变基因，在体外及转基因小鼠中治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，简称ALS）的基因治疗方法。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为ALS基因治疗的候选病毒。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种AAV9病毒载体介导的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的sgRNA及其用途，包含与该sgRNA的组合物、重组表达载体和基因治疗方式。

背景技术

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一种致死性的神经退行性疾病，作为运动神经元病的一个类型(ALS/MND)，是最常见的成年发病的运动神经元疾病。ALS与阿尔茨海默病、帕金森病同为神经系统常见变性疾病，但发展速度和性质较其他两种变性疾病更加严重。患者以脊髓、脑干、大脑皮层的运动神经元发生退行性改变为特征，表现为进行性肌肉无力，多死于呼吸衰竭；成年发病，中位生存期仅为3-5年[1]。其患病率4-6/10万，发病率1-3/10万。至今尚无有效的治疗方法[2]。现临床上用于治疗ALS的药物“力如太”仅能延缓病程数月。神经科专家多称ALS为“不是癌症的癌症”。由于本病好发于中年人群，即社会及家庭的主要支撑人群，因此给家庭带来了沉重的负担，对国家和社会造成了严重的危害。通过建立有效的治疗措施，不仅能减轻患者的痛苦，而且会给家庭、国家及社会减轻负担。

ALS以散发病人多见，约占总病人的90％，家族性约占10％。基因突变是ALS鉴定明确的病因。超过50％的家族性肌萎缩侧索硬化(FALS)病人的相关致病基因已经发现，其中包括：C9orf72(24％)，SOD1(20％)，TDP-43(5％)，FUS(5％)等。散发性肌萎缩侧索硬化(SALS)病人中包括：C9orf72(4％)，SOD1(2％)，TDP-43(1％)，FUS(1％)等[3]。对突变基因进行基因编辑，修复突变基因有可能从根本上阻止运动神经元变性。

成簇的规律间隔的短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Cas9)系统是最近建立的能够在真核细胞中应用的，由RNA调控对DNA修饰的基因编辑系统。与其他编辑系统相比，如锌指核酸酶(ZFNs)和类转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，CRISPR-Cas9系统编辑效率和靶向性更高，打靶容易，具有多位点修饰等特点[4,5]。Cas9核酸酶在sgRNA的引导下介导目的基因的原间区毗邻序列(PAM序列，NGG)上游3个碱基的双链断裂，Cas9上的HNH结构域切割与sgRNA形成互补的单链DNA，Ruv C结构域切割非互补的单链，通过内源性DNA修复，进行非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)，形成插入或缺失突变(indel mutation)，完成基因敲除；在模板链存在的条件下，完成同源重组修复(Homology-Directed Repair,HDR)[6-8]。

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体作为一类新型的安全载体，其重要性正被研究者逐渐认识到。它是细小病毒家族成员，为无包膜的线性单链DNA病毒，具有广泛的宿主范围，既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，并能介导外源基因的长期表达。作为病毒载体的重要一员，AAV不具有明显的细胞毒性效应，并且不会像其他病毒载体那样引起细胞强烈的免疫反应；同时在构建重组AAV病毒时，可使其编码序列完全缺失而仅保留其145bp的末端重复序列，从而有效降低其重组和表达自身蛋白的可能性，使安全性得到进一步提高。因此，AAV作为一种理想的基因治疗载体，正在越来越多地引起人们兴趣和关注[9,10]。