[发明专利]一种动物角类药材角质层的DNA提取方法

权利要求书

1.一种动物角类药材角质层的DNA提取方法，包括样品前处理、取样、DNA提取，其特征在于：具体步骤为：

（1）样品前处理：取收集到的动物角类药材样品，所述动物角类药材样品为个子样品，其处理方法为：先将样品用电锯切割横截面，将样品切割成片状，然后将片状样品用刀片刮去外层污染，取内层，削成细薄片；

（2）取样：称取样品25-70mg，加入DTT20-100µl，Proteinase K 40µl及裂解缓冲液GA400µl后，56℃金属浴酶解3-4小时后提取DNA；

（3）DNA提取：按试剂盒提取步骤提取DNA，Nano Drop 2000测定DNA的浓度及纯度；

（4）提取的DNA样本进行PCR扩增：扩增引物为CO1基因的通用引物，正向引物LCO14905′-ggTCAACAAATCATAAAgATATTgg-3′反向引物HCO2198 5′-TAAACTTCAgggTgACCAAAAAATCA-3′，

25µl反应体系，模板用量为150~180ng；低于150~180ng时，模板取样定为10µl；浓度为10mmol/L的正向、反向引物各1µl；2×EasyTag SuperMix 12.5µl；双蒸水补足至25µl；PCR扩增程序为：94℃1min；94℃，1min，45℃，1.5min，72℃，1.5 min，5个循环；94℃，1min，50℃，1.5min，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；用含有GoldView I 型核酸染色剂的1.5%琼脂糖凝胶点样，DL 2，000 DNA Marker 为对照，样品5µl与2µl 6×Loading Buffer 混合均匀点样，TBE缓冲液中电泳，凝胶成像仪成像；割取750bp处的DNA条带，胶回收纯化PCR产物，测序；

（5）低浓度样品进行二次扩增：样品浓度为10~14ng/µl，不能测序时，进行二次扩增：提取的DNA第一次扩增后，紫外灯下割取750bp处的条带，切成碎块，100µl双蒸水溶解，60℃温育，模板用量5µl，进行二次扩增；浓度为10mmol/L的正向、反向引物各1µl；2×EasyTagSuperMix 12.5µl；双蒸水补足至25µl；扩增程序为95℃1min，40℃，1min，72℃，1.5min，72℃，1.5 min，35个循环模，72℃，保存7min；1.5%琼脂糖点样，TBE缓冲液电泳，凝胶成像仪成像，割取750bp处的DNA条带，胶回收纯化PCR产物，测序。

2.根据权利要求1所述的一种动物角类药材角质层的DNA提取方法，其特征在于：步骤（2）中称取样品量为25mg，加入DTT量为20µl。