[发明专利]一种动物角类药材角质层的DNA提取方法

说明书

本发明属于中药材鉴定技术领域，为解决现有动物角类药材DNA的提取方法存在角质细胞裂解不彻底，提取的DNA模板浓度低，DNA降解严重的角类药材无法进行PCR的问题，提供一种动物角类药材角质层的DNA提取方法。样品前处理、取样、DNA提取，提取的DNA样本进行PCR扩增，低浓度样品进行二次扩增。确定了取样量为25mg，DTT用量为20µl，角质细胞裂解完全，DNA质量可满足PCR要求。建立角类动物药材角质层的DNA提取方法，使提取的DNA质量满足常规PCR要求。建立的DNA提取方法，提取DNA完全，可标准化操作，可应用于多种动物角的提取。

技术领域

本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种动物角类药材角质层的DNA提取方法。

背景技术

在祖国医学中，一些动物角有显著的临床疗效。如羚羊角具有平肝熄风，清肝明目，散血解毒的功效；水牛角具有清热凉血，解毒，定惊的功效。因角类动物药材资源有限，价格昂贵，易混品较多，传统鉴定方法主要依赖经验丰富的鉴定专家，一般中药材质量验收人员缺乏性状鉴别经验，难以确保用药有效性。现代分子生物学技术不受样品状态影响，可通过分析其遗传物质DNA的差异实现对动物物种的鉴定。存在于动物线粒体的CO1基因已在鱼类、鸟类等分类中得到成功的运用，能有效识别新物种，被认为是全球动物物种鉴定的通用条形码，其片段序列可作为种内多样性和种间特异性的一种新的身份识别系统。目前，对于动物药及混伪品的鉴定多通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增线粒体上的CO1基因，通过序列比对、计算遗传距离、构建系统发育树等来分析正品及混伪品。该技术已用在多种动物药材的不同组织样本如（肌肉、血液）的DNA扩增，并取得较好的研究结果。然而，对于角类部位的DNA提取，已有文献采用通用动物组织（肌肉、血液）的DNA提取方法，该方法对于像角类药材这样的坚硬样本存在角质细胞裂解不彻底，提取出的DNA模板浓度低，尤其是长时间放置，DNA降解严重的角类药材无法进一步PCR。

发明内容

本发明为了解决现有动物角类药材DNA的提取方法存在角质细胞裂解不彻底，提取的DNA模板浓度低，DNA降解严重的角类药材无法进行PCR的问题，提供了一种动物角类药材角质层的DNA提取方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种动物角类药材角质层的DNA提取方法，包括样品前处理、取样、DNA提取，具体步骤为：

（1）样品前处理：取收集到的动物角类药材样品，所述动物角类药材样品为个子样品，其处理方法为：先将样品用电锯切割横截面，将样品切割成片状，然后将片状样品用刀片刮去外层污染，取内层，削成细薄片；所述动物角类药材样品为块状样品，其处理方法为：用刀片刮去外层污染后，取内层，削成细薄片；所述动物角类药材样品为丝状样品，其处理方法为：用75%乙醇清洗3次，双蒸水冲洗至无醇味，紫外光下照射，晾干；消毒剪剪成碎片，备用；

（2）取样：称取样品25-70mg，加入DTT20-100µl，Proteinase K 40µl及裂解缓冲液GA 200µl后，56℃金属浴酶解3-4小时后提取DNA；

（3）DNA提取：按试剂盒提取步骤提取DNA，Nano Drop 2000测定DNA的浓度及纯度；

（4）提取的DNA样本进行PCR扩增：扩增引物为CO1基因的通用引物，正向引物LCO1490 5′-ggTCAACAAATCATAAAgATATTgg-3′反向引物HCO2198 5′-TAAACTTCAgggTgACCAAAAAATCA-3′，