[发明专利]一种DNA分子STTM‑miR482a及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种STTM-miR482a及其在抑制植株microRNA482a功能中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类长约22nt的内源RNA，是生物体内重要的转录后调控因子之一，参与调节植物的生长发育以及胁迫响应等过程。成熟的miRNA与AGO1蛋白等组成RNA诱导的沉默复合体对靶基因进行切割或抑制其翻译，从而发挥调控作用。最近，有研究发现拟南芥中IPS1基因与miR399之间可以通过碱基互补配对方式结合，IPS1基因在切割位点处形成了3个碱基的错配环，该错配环使miR399不能对IPS1基因进行切割，同时也避免IPS1基因被降解。当IPS1过表达时，其与miR399结合，从而导致miR399不能与其靶基因结合，使miR399失去了原有的调控作用，IPS1被称为内源的靶基因模拟物。后来研究者用人工设计的48nt的接头将两个内源的靶基因模拟物片段连接在一起形成短串联靶模拟(Short Tandem Target Mimic-STTM)。STTM可以作为沉默miRNA的工具，应用于miRNA的相关研究。自从miR482在毛果杨中第一次被发现以来，人们已在多种植物中如拟南芥、烟草、番茄发现了miR482。在未受病原菌侵染时，植物会利用miR482沉默体内大部分的NBS-LRR基因。NBS-LRR基因是一个植物体内抗病基因的大家族，当病原物侵染植物时，NBS-LRR识别病原体分泌的效应蛋白，引起植物的超敏反应，进一步抑制病原物的扩散。抑制番茄中miR482的表达，可以有效的解除miR482对NBS-LRR基因的沉默作用，提高植物的抗病性。在现有的技术中，利用STTM技术提高植物抗病性的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于开发一种DNA分子STTM-miR482a，并将其应用于调控microRNA482a功能。

上述目的为达到，本发明提供了一种DNA分子STTM-miR482a，其核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述DNA分子STTM-miR482a的应用，具体为将表达DNA分子STTM-miR482a的重组载体用于调控植物中microRNA482a表达、调控植物抗病性，尤其适用于提高植物的抗晚疫病性；

所述microRNA482a的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

所述调控的具体方法为：将所述表达DNA分子STTM-miR482a的重组表达载体转化农杆菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、链霉素及利福平的YEB固体培养基上，挑取单菌落进行菌液PCR验证。选取阳性工程菌侵染预培养后的番茄子叶，共培养，分化出芽，将抗性芽移至生根培养基中诱导生根后移栽，实时定量PCR验证即得到可调控microRNA482a表达的转基因植物。

含有本发明STTM-miR482a DNA分子的转基因植物的抗病性高于其他目的植物。

优选方式下，所述目的植物为双子叶植物番茄。

上述重组表达载体优选含有DNA分子STTM-miR482a的载体。

上述应用中，将DNA分子分子STTM-miR482a插入表达载体中，即得到表达STTM-miR482a的重组表达载体。

优选方式下，所述表达载体为PBI121载体；上述表达STTM-miR482a的重组表达载体的具体制备方法为：将所述DNA分子STTM-miR482a插入PBI121载体的SacⅠ和Bam HⅠ之间，且插入的位置为CaMV35s启动子之后，即得到表达STTM-miR482a的重组表达载体，本发明将该重组表达载体命名为PBI-STTM-miR482a。

本发明的技术创新在于：

1、本发明获得了过表达STTM-miR482a的转基因番茄植株。

2、本发明DNA分子通过抑制野生型番茄中microRNA482a的表达得到转基因番茄，与野生型番茄相比，对晚疫病的抗性增强。

3、本发明对培育抗晚疫病的番茄品种，提高番茄产量具有重要意义，以及为其他植物的抗病性研究提供依据。

附图说明

图1为过表达载体pBI-STTM-miR482a的物理图谱；

图2为转STTM-miR482a番茄中miR482a的表达情况；

图3为转STTM-miR482a番茄离体叶片的抗病性检测；

图4为转STTM-miR482a番茄植株的抗病性检测。

具体实施方式