[发明专利]视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系及其蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种视黄醇结合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，由以下步骤制备得到：

人工合成链接有FAD合成酶的视黄醇结合蛋白基因，通过PCR反应程序得到扩增基因产物；

PCR扩增的引物为RBPF：ATCGCCATGGATGCTGCATCAGCCGACC和RBPR：ATCGCTCGAGTTACTGCACTTTTTTAAACACC；

所述链接有FAD合成酶的视黄醇结合蛋白基因的基因序列为：

ATGCTGCATCAGCCGACCGTGGAAGTGACCGATGATGCGAGCGTGCGTCGTCGTCCGCGTGCGGTGGCGATTGGCGTGTTTGATGGCGTGCATATTGGCCATGCGCAGGTGATTGCGGGCTGCGATACCGTGCTGACCTTTGATCCGCATCCGCTGCAGGTGCTGCGTCCGGATGATGTGCCGGCGCTGCTGACCACCGTGCCGACCAAAGTGGCGCGTCTGGCGGCGCTGGGCGTGCGTGAAGTGGTGGTGCTGCGTTTTGATGCGCGTTGGGCGGCGGTGGCGGCGCCGAGCTTTGTGGATGATCTGCTGGTGGGCCGTCTGGGCGCGCATACCGTGAGCGTGGGCGCGAACTTTCGTTTTGGCGCGGGCGGCGAAGGCAGCGGCCATGTGCTGCGTCGTGATGGCCGTTTTCGTACCCGTGTGACCCCGCTGGTGCGTAGCGCGGCGGGCGTGGTGAGCAGCAGCCGTATTCGTGCGAGCCTGAGCAGCGGCGATATTGGCGCGGTGACCCGTCTGCTGGGCCGTCCGCATGCGCTGACCGGCCGTGGCGCGCCGGGCCGTAGCGTGGTGGTGGATACCGGCCTGGCGGTGCCGCCGGCGGGCCGTTATCGTGTGCTGGTGAACGATGTGCCGACCCATGCGGTGGTGGATGATCGTGGCCGTATTACCGTGGATGAACAGCTGCGTGGCCGTGTGGAACTGGTGCTGCGTTGCCGTGTGGATCGTCCAACTTTGTACAAAAAAGTGCCGGTGGATTTTACCGGCTATTGGAAAATGCTGGTGAACGAAAACTTTGAAGAATATCTGCGTGCGCTGGATGTGAACGTGGCGCTGCGTAAAATTGCGAACCTGCTGAAACCGGATAAAGAAATTGTGCAGGATGGCGATCATATGATTATTCGTACCCTGAGCACCGTTCGTAACTATATTATGGATTTTCAGGTGGGCAAAGAATTTGAAGAAGATCTGACCGGCATTGATGATCGTAAATGCATGACCACCGTGCGCTGGGATGGCGATAAACTGCAGTGCGTGCAGAAAGGCGAAAAAGAAGGCCGTGGCTGGACCCAGTGGATTGAAGGCGATGAACTGCATCTGGAAATGAGTGTGGAAGGCGTGGTGTGCAAACAGGTGTTTAAAAAAGTGCAGTAA

将所述扩增基因产物用NcoI和XhoI双酶切，并串联构建到NcoI和XhoI双酶切后的pET30a载体上，构建成为视黄醇结合蛋白表达载体；

将所述视黄醇结合蛋白表达载体转化至大肠杆菌细胞中获得视黄醇结合蛋白基因工程菌的大肠杆菌表达体系。

2.如权利要求1所述的视黄醇结合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌采用菌株BL21(DE3)。

3.一种视黄醇结合蛋白的发酵制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在发酵初始培养基中接入细菌种子培养基，调节pH为6.5～7.3，并保持温度为37℃，溶氧量大于20％，接入如权利要求1或2所述的视黄醇结合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，使菌体自然生长；

当培养基中糖份基本耗尽时，保持温度为37℃，将通气量加大至2L/min，加入第一补料液加速诱导；然后匀速加入第二补料液；当第一补料液加入时开始，每4h加入第三补料液，待养分耗尽后收集菌体；所述第一补料液包括酵母提取物、胰蛋白胨和乳糖；所述第二补料液包括甘油和乳糖；所述第三补料液包括FAD和磷酸钠溶液。

4.一种视黄醇结合蛋白的复性方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用Urea和Tris溶液冲平Ni-IDA琼脂糖柱；将变性蛋白低温离心去除不溶物后上柱，所述变性蛋白为视黄醇结合蛋白经纯化工艺得到，所述视黄醇结合蛋白利用如权利要求1或2所述的视黄醇结合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株制备得到；

上柱完成之后，用Urea和Tris溶液冲平亲和柱，将不易吸附的杂质清洗干净，然后用imI、Urea及Tris溶液洗去蛋白；

依次用Urea溶液、Urea和FAD的混合溶液及Tris和FAD的混合溶液冲洗所述Ni-IDA琼脂糖柱后完成视黄醇结合蛋白的复性。