[发明专利]视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系及其蛋白的制备方法

说明书

本发明涉及微生物分子生物学领域，特别涉及视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系及其蛋白的制备方法。一种视黄醇结合蛋白基因工程菌的大肠杆菌表达体系包括以下步骤：人工合成链接有FAD合成酶的视黄醇结合蛋白基因，通过PCR反应程序得到扩增基因产物；PCR扩增的引物为RBPF：ATCGCCATGGATGCTGCATCAGCCGACC和RBPR：ATCGCTCGAGTTACTGCACTTTTTTAAACACC；将所述扩增基因产物用NcoI和XhoI双酶切，并串联构建到NcoI和XhoI双酶切后的pET30a载体上，构建成为视黄醇结合蛋白表达载体；将所述视黄醇结合蛋白表达载体转化至大肠杆菌细胞中获得视黄醇结合蛋白基因工程菌的大肠杆菌表达体系。本发明的有益效果在于：能够解决现有技术中所面临的产量少，纯度低，复性率低等问题，经济有效的解决现有技术中存在的问题。

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学领域，特别涉及视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系及其蛋白的制备方法。

背景技术

正常人尿中视黄醇结合蛋白(RBP)含量很少，约为0.1μg/min以下，其排量增加被认为是一种敏感的近端肾小管损伤的诊断指标。视黄醇结合蛋白与尿白蛋白、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)等有显著的正相关。在碱性环境中较β2-MG稳定，在37℃温度下亦不分解(而β2-MG在pH 5.5以下时迅速分解，室温放置2小时后，有80％会被分解掉)。而尿视黄醇结合蛋白作为肾小管损伤的指标较NAG敏感。在疾病状态下，尿视黄醇结合蛋白浓度又是NAG的10倍。因此，尿视黄醇结合蛋白的测定比NAG和β2-MG更有价值，是更实用、可靠的肾功能指标，当肾小管功能受损时，尿中视黄醇结合蛋白可明显增高，较肌酐、尿素更准确灵敏。。

肝病患者血清中视黄醇结合蛋白显著低于正常人，且急性病毒性肝炎病程早期血清视黄醇结合蛋白含量降低较晚期更明显。血清视黄醇结合蛋白水平能准确、灵敏地反映肝功能变化。甲亢患者视黄醇结合蛋白水平较正常人低，甲减患者视黄醇结合蛋白水平高于正常人。此外，当血清视黄醇结合蛋白低于正常一半时，患者才出现暗适应能力降低，提示血清视黄醇结合蛋白含量能更灵敏地反映维生素A缺乏症。

可见视黄醇结合蛋白水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标，具有广阔的应用前景。为了更准确的对视黄醇结合蛋白水平进行检测，检测试剂盒或色谱检测常需要标准品。目前，制得视黄醇结合蛋白的方法主要是从血浆分离纯化，但是视黄醇结合蛋白在血浆中含量较少，从血或肾病综合征尿液中分离视黄醇结合蛋白，所需样品量大，成本高，步骤繁琐，且不易得到有活性的视黄醇结合蛋白。近年来，有学者和专家研究和利用基因工程的方法制得视黄醇结合蛋白，具有较高的安全性，且繁殖速度快，能够大规模生产，降低成本，还能够高效表达目的基因，可诱导调控，易于分离提纯；但传统的工艺手段往往存在产量过低，复性率不高等问题。

发明内容

本发明的目的是提供视黄醇结合蛋白基因工程菌的构建及其蛋白的制备、复性方法，利用基因工程手段人工合成编码RBP的基因在原有基因片段上增加FAD合成酶基因片段，构建基因工程菌株，能够解决现有技术中从血浆中分离纯化视黄醇结合蛋白所面临的问题，经济有效的解决现有技术中存在的问题。

本发明具体技术方案如下：

一种视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系，包括以下步骤：

人工合成链接有FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)合成酶的视黄醇结合蛋白基因，通过PCR(聚合酶链式)反应程序得到扩增基因产物；

PCR扩增的引物为

RBPF(正向引物)：ATCGCCATGGATGCTGCATCAGCCGACC和

RBPR(反向引物)：ATCGCTCGAGTTACTGCACTTTTTTAAACACC；