[发明专利]一种检测EGFR基因突变的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学的基因突变诊断领域，更具体涉及一种检测EGFR基因突变的方法及试剂盒。

背景技术

近年来利用分子靶向药物治疗肿瘤的技术高速发展，该法不同于传统化疗，其利用靶向药物通过与肿瘤细胞的特征性位点结合，干预控制肿瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路；不会对正常细胞造成损伤，具有巨大的优势。

人类表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是由1186个氨基酸构成的分子量大小在170kD的跨膜糖蛋白，主要位于细胞膜上，在大部分正常上皮细胞中广泛表达，其结构包括细胞外结合区、跨膜区及主要由酪氨酸激酶组成的细胞内区等，属于受体酪氨酸激酶(TKI)家族。EGFR可以激活酪氨酸激酶，从而打开下游的信号传导与转录活化因子通路等，最终介导细胞分化、生存、迁移、侵袭、粘附和细胞损伤修复等一系列过程，在肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡抑制及血管生成中发挥着重要作用。因此，EGFR已经成为相关肿瘤尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)靶向治疗的一个重要靶点。

EGFR基因突变是重要的癌症驱动因子，主要集中于编码酪氨酸激酶结构域的外显子18-21区。19号外显子的突变主要是第746-752位密码子的碱基缺失突变，导致外显子编码的4个高保守氨基酸(Leu-Arg-Glu-Ala)序列丢失；21号外显子多为点突变，主要是第858位密码子出现T-G转换，使该位点的亮氨酸转变为精氨酸，简称为L858R。18号外显子G719X突变和20号外显子T790M突变也是较常见的突变，这几类突变占比90％以上。

目前临床上EGFR的靶向治疗主要基于小分子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)和单克隆抗体两种机制。其中基于EGFR-TKI机制的吉非替尼(Gefitinib，商品名易瑞沙)和厄洛替尼(Erlotinib，商品名特罗凯)，是目前肿瘤患者最有效的靶向药物。与此同时，肿瘤细胞具有多样性，并非所有肿瘤细胞都具有一样的特征性位点，导致这些靶向药物并非对所有患者有效。已有大量研究表明，EGFR基因外显子的突变是此类靶向药物对患者有效的必要前提。

由于EGFR-TKI类的靶向药物价格昂贵，如果病人不携带EGFR突变而服用此类药物，不但耽误病情而且还造成巨额经济损失。因此，用药前筛查肿瘤患者的EGFR突变是保证安全、有效用药的必要流程，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。美国国家癌症综合网络(NCCN)已经将EGFR基因检测作为非小细胞肺癌等的靶向药物选用的前提列入了肿瘤临床实践指南。

目前常用的基因突变检测方法主要是测序法与ARMS-PCR法。ARMS法可同时检测肿瘤组织中多种已知的常见突变，具有灵敏度高(可测出低至1％水平的突变)，操作简单，检测快速等优点；然而对于取样方便的血液样本如循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量过低，ARMS-PCR法不足以对其进行检测，同时该类试剂盒检测成本过高限制了在临床上的推广及应用。测序法是基因突变及多样性检测的金标准，具有技术成熟、结果准确和全面等优点，相比ARMS法检测费用低廉并且还能测出未知突变；而目前测序法主要的不足在于操作复杂，且检测灵敏度过低，只有突变达到大于10％甚至20％才能被可靠检出。

基于上述原因，本发明涉及到设计一套新型的多重PCR引物，并引入分子标签技术，对于DNA片段的模板进行唯一性标记并扩增，同时结合二代测序技术，开发了一种对于组织样本以及血液样本通用型的、简便的，对EGFR基因的突变进行测序和分析的方法以及其检测试剂盒。

发明内容

本发明目的在于提供了一种基于多重PCR及高通量测序技术的EGFR基因突变的检测方法及试剂盒，旨在解决现有技术中步骤繁杂，检测灵敏度低、检测周期长的问题。

在本发明的一方面，提供一种检测EGFR基因突变的引物，其中通用引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的特异性引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的特异性引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的特异性引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的特异性引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。